Análisis de asociación de la microbiota intestinal

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9225 (2023) Citar este artículo

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Se encontró hiperactivación del eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HPA) y del eje hipotalámico-pituitario-tiroideo (HPT) en el desafío agudo a gran altitud, pero se desconoce el papel de la microbiota intestinal y los metabolitos. Utilizamos ratas Sprague-Dawley macho adultas a una altitud simulada de 5500 m durante 3 días en una cámara hipobárica-hipóxica. Luego se realizaron análisis ELISA y metabolómicos de suero y 16S rRNA y análisis metabolómicos de muestras fecales. En comparación con el grupo normóxico, la hormona liberadora de corticotropina sérica (CRH), la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), la corticosterona (CORT) y la tiroxina (tT4) aumentaron en el grupo de hipoxia, mientras que la hormona liberadora de tirotropina (TRH) disminuyó. Bacteroides, Lactobacillus, Parabacteroides, Butyricimonas, SMB53, Akkermansia, Phascolarctobacterium y Aerococcus se enriquecieron en el grupo de hipoxia, mientras que [Prevotella], Prevotella, Kaistobacter, Salinibacterium y Vogesella se enriquecieron en el grupo normóxico. El análisis metabolómico indicó que la hipoxia aguda afectó significativamente el metabolismo de los lípidos fecales y séricos. Además, encontramos que cinco metabolitos fecales pueden mediar la interacción entre TRH, tT4 y CORT con [Prevotella], Kaistobacter, Parabacteroides y Aerococcus, y 6 metabolitos séricos pueden mediar el efecto de TRH y tT4 en [Prevotella] y Kaistobacter por análisis de mediación causal. En conclusión, este estudio proporciona nueva evidencia de que los metabolitos clave median la interacción entre la microbiota intestinal con el eje HPA y HPT bajo el desafío de la hipoxia hipobárica aguda.

El rápido ascenso de la gente de las llanuras a grandes alturas por encima de los 2500 m suele experimentar el mal agudo de montaña (MAM), que se presenta con una combinación de síntomas que incluyen insomnio, fatiga, mareos, anorexia y náuseas, con vómitos1. Los problemas gastrointestinales2 pueden afectar la microbiota intestinal en poblaciones expuestas a grandes altitudes. Se ha encontrado que Prevotella se enriqueció en heces de tibetanos a gran altura (3600 m), mientras que Bacteroides se enriqueció en heces de Han3. Los tibetanos que viven a 4800 m tienen una flora rica en bacterias productoras de butirato3. Los miembros de la expedición expuestos a altitudes superiores a 5000 m experimentaron una disminución significativa de probióticos intestinales, como las bifidobacterias en las heces, y un aumento significativo de bacterias patógenas intestinales4.

La hiperactividad neuroendocrina puede estar implicada en la regulación de la función inmunitaria, el estrés vascular, el metabolismo energético, las emociones y el sueño5,6. Varios estudios han demostrado cambios en varias concentraciones de hormonas a gran altura, incluido el aumento de norepinefrina y cortisol7,8, un aumento agudo de la hormona estimulante de la tiroides (TSH), tiroxina (tT4), tiroxina libre (fT4), triyodotironina (tT3) y triyodotironina libre (fT3)9,10,11, que luego puede recuperarse o disminuir gradualmente bajo la exposición crónica a la hipoxia10,11,12. Sin embargo, los mecanismos de activación del eje HPA y HPT bajo hipoxia hipobárica aguda (AHH) aún no se comprenden bien.

Curiosamente, nuestro trabajo anterior mostró que la microbiota intestinal, el eje HPA y las hormonas del eje HPT han cambiado significativamente en ratas a una altitud simulada de 5500 m, especialmente en la fase aguda13. Los mecanismos aún no se dilucidaron por completo, aunque se ha encontrado una correlación entre las hormonas y la microbiota intestinal mediante el análisis de correlación de Spearman.

Como posible órgano endocrino, la microbiota intestinal produce metabolitos con funciones de señalización o sustancias químicas con propiedades hormonales, como ácidos grasos de cadena corta (AGCC), neurotransmisores, precursores de compuestos neuroactivos, ácidos biliares y metabolitos de colina, hormonas gastrointestinales y componentes bacterianos14 ,15. Las bacterias secretan metabolitos en la luz intestinal y los transportan a los órganos efectores (p. ej., el cerebro) a través de la sangre. A su vez, las bacterias en el intestino pueden responder a las hormonas del huésped, lo que afecta la homeostasis de la microbiota y la producción de metabolitos, lo que podría afectar el estado patológico del huésped. Por ejemplo, la norepinefrina elevada estimula el crecimiento de E. coli comensal no patógena y otras bacterias gramnegativas en el intestino16. Las alteraciones en la composición microbiana intestinal y la permeabilidad intestinal también afectan el eje HPA y las hormonas del eje HPT17. Tal diálogo cruzado entre el huésped y la microbiota intestinal puede ser susceptible al estrés ambiental y juega un papel importante en la adaptación a la hipoxia.

En conjunto, proporcionará nuevos conocimientos sobre el mecanismo de interacción de la microbiota intestinal-metabolito-neuroendocrino para explorar los metabolitos críticos que median la correlación entre los microbios intestinales y las hormonas neuroendocrinas del huésped bajo la exposición a AHH. Por lo tanto, exploramos la interacción entre los microbios intestinales y el eje HPT del huésped y las hormonas del eje HPA mediadas por metabolitos fecales y séricos en ratas macho Sprague-Dawley a una altitud simulada de 5500 m durante 3 días y proporcionamos datos de protección médica para poblaciones de gran altitud.

En comparación con el control, el peso corporal del grupo de hipoxia se redujo significativamente (control: 337,55 ± 21,74 g frente a hipoxia: 270,95 ± 9,88 g, prueba t, p < 0,0001). La ingesta de alimentos del grupo de hipoxia disminuyó durante la exposición aguda a la hipoxia (ingesta de alimentos promedio del grupo de hipoxia: 9,65 g/día/rata, ingesta de alimentos promedio del grupo de control: 25,29 g/día/rata). En comparación con el control, los niveles séricos de CRH (prueba t, p < 0,0001), ACTH (prueba t, p = 0,0006) y CORT (prueba t, p < 0,007) aumentaron significativamente (Fig. 1a-c) , mientras que TRH (prueba t, p <0,0001) y tT4 (prueba t, p = 0,0058) disminuyeron significativamente (Fig. 1d, e) en el grupo de hipoxia. No hubo cambios significativos en los niveles de TSH, fT4, fT3 o tT3 (Fig. 1a-d complementaria, prueba t, p> 0.05).

Efecto de la altitud simulada a 5500 m sobre las hormonas del eje HPT y del eje HPA. Niveles séricos de CRH (a), ACTH (b), CORT (c), TRH (d), tT4 (e). Los datos se expresaron como media ± SEM. n = 6/grupo. ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001 en comparación con el grupo de control utilizando pruebas t no apareadas de dos colas. CRH hormona liberadora de corticotropina, ACTH hormona adrenocorticotrópica, CORT corticosterona, TRH hormona liberadora de tirotropina, tT4 tiroxina.

Sobre la base de una similitud de secuencia del 97 %, se identificaron 22 248 unidades taxonómicas operativas (OTU) y luego se asignaron a 38 filos, 99 clases, 160 órdenes, 198 familias y 254 géneros. La exposición a la hipoxia aguda no tuvo una influencia significativa en la diversidad alfa medida con el índice de Shannon, Chao 1 u OTU observadas (Fig. 2a, prueba de Mann Whitney, p> 0.05). Un gráfico de análisis de coordenadas principales (PCoA) de las distancias Bray-Curtis confirmó que las muestras se agruparon y separaron entre grupos (Fig. 2b). El análisis discriminante lineal Tamaño del efecto (LEfSe)18 identificó 13 géneros diferenciales. Firmicutes y Verrucomicrobia se enriquecieron significativamente en el grupo de hipoxia a nivel de filo (Fig. 2c, d, puntaje LDA> 3, prueba de suma de rangos KW y prueba de Wilcoxon por pares, p <0.05). Bacteroides, Lactobacillus, Parabacteroides, Butyricimonas, SMB53, Akkermansia, Phascolarctobacterium y Aerococcus se enriquecieron en el grupo de hipoxia, mientras que [Prevotella], Prevotella, Kaistobacter, Salinibacterium y Vogesella se enriquecieron en el grupo normóxico a nivel de género (Fig. 2c, d , puntuación LDA > 3, prueba de suma de rangos KW y prueba de Wilcoxon por parejas, p < 0,05).

Efecto de la altitud simulada a 5500 m sobre la microbiota intestinal. ( a ) La diversidad alfa en la microbiota intestinal se analizó mediante el índice de Shannon utilizando la prueba de Mann Whitney. Los datos se expresaron como media ± SEM, n = 6/grupo. ( b ) Gráfico de análisis de coordenadas principales (distancia Bray-Curtis) de la estructura de la comunidad microbiana intestinal. ( c ) Histogramas de puntajes de análisis discriminante lineal (LDA) clasificados (umbral> 3, p <0.05) calculados para características diferencialmente abundantes entre el grupo de hipoxia (bloques verdes) y el grupo de control (bloques rojos), y ( d ) mapeo de cladograma del Las diferencias en la composición de la microbiota intestinal entre el grupo de hipoxia (bloques verdes) y el grupo de control (bloques rojos) en los árboles taxonómicos generados por LEfSe mostraron diferencias significativas en la composición microbiana intestinal.

Las diferencias en los perfiles de metabolitos de las heces y el suero entre los grupos de hipoxia y normoxia se revelaron mediante el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) (Fig. 3a, b). Se identificaron un total de 2945 metabolitos en heces y 1457 metabolitos en suero. El análisis multivariado identificó 233 metabolitos diferenciales en heces y 66 metabolitos diferenciales en suero con valor de corte de importancia variable en la proyección (VIP) superior a 1 y valor de p inferior a 0,05 (pruebas t, Fig. 2a complementaria), de los cuales 9 Los metabolitos se co-regularon a la baja en suero y heces, incluidos cinco fosfátidos de glicerilo (LysoPE (0: 0/20: 2 (11Z, 14Z)), LysoPE (0: 0/24: 6 (6Z, 9Z, 12Z, 15Z, 18Z) ,21Z)), PC(18:2(2E,4E)/0:0), PE(16:0/18:2(9Z,12Z)) y PS(P-20:0/22:4( 7Z,10Z,13Z,16Z))), dos ácidos grasos de cadena larga (2E,5Z,8Z,11Z,14Z-ácido eicosapentaenoico y ácido palmítico), un lípido de prenol (cadineno) y un acilo graso (muricoreacina)( Figura complementaria 2b-j). La visualización de los 50 metabolitos diferenciales principales clasificados según los valores de VIP en las heces y el suero se muestran en la Fig. 4a, b, respectivamente. Los metabolitos diferenciales en las heces fueron principalmente acilos grasos, lípidos de prenol, glicerofosfolípidos y esteroides y derivados de esteroides (Fig. 5a). Los metabolitos del suero significativamente alterados fueron principalmente los glicerofosfolípidos, los acilos grasos y los esfingolípidos (Fig. 5b). En particular, la mayoría de los metabolitos de glicerofosfolípidos y acilos grasos en suero se regularon a la baja bajo exposición a hipoxia aguda (Fig. 5b). Además, se utilizó el análisis de rutas de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) para mapear metabolitos séricos y fecales alterados en rutas de metabolismo. El resultado reveló que las vías co-cambiadas en heces y suero fueron "Biosíntesis de ácidos grasos insaturados" (Fig. 5c, d, metabolitos fecales: p = 0,0029, metabolitos séricos: p = 0,0349) y "Biosíntesis de ácidos grasos" (Fig. 5c, d, metabolitos fecales: p = 0,0292, metabolitos séricos: p = 0,0317). Además, las vías modificadas de los metabolitos fecales también incluyeron el "metabolismo del ácido araquidónico" (Fig. 5c, p < 0,0001) y la "vía de señalización de PPAR" (Fig. 5c, p = 0,0274), y metabolitos séricos enriquecidos en "Degradación de ácidos grasos" (Fig. 5d, p = 0,0003) y "Elongación de ácidos grasos en las mitocondrias" (Fig. 5d, p = 0,0175).

Efecto de la altitud simulada a 5500 m sobre la metabolómica fecal y sérica. Gráfica de análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) de metabolitos fecales (a) y séricos (b). FC heces del grupo control, FH heces del grupo hipoxia, SC suero del grupo control, SH suero del grupo hipoxia. n = 6/grupo.

Mapa de calor de los 50 metabolitos alterados principales clasificados por importancia variable en la proyección (VIP) en heces (a) y suero (b) con un valor de corte de VIP > 1 y p < 0,05 (pruebas t).

Clasificación y análisis de la vía KEGG de metabolitos alterados. El cuadro de mariposa mostró la clasificación de los metabolitos alterados (hipoxia vs. control) en heces (a) y suero (b). Análisis de la vía KEGG (https://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html) de metabolitos diferenciales en heces (c) y suero (d). El gráfico de burbujas mostró el mapeo de metabolitos diferenciales en las rutas de metabolismo correspondientes. Las líneas punteadas indicaron el valor p de corte de 0,05. El tamaño de la burbuja indica el recuento de metabolitos alterados incluidos en cada vía KEGG. n = 6/grupo.

Los metabolitos juegan un papel importante en el contexto de las interacciones huésped-microbiota. Por lo tanto, luego exploramos los metabolitos fecales y séricos clave que median la interacción entre las hormonas con la microbiota intestinal mediante el análisis de mediación causal (CMA). Como se muestra en la Fig. 6, se pudo identificar una relación causal significativa entre la microbiota intestinal y las hormonas alteradas mediadas por 6 metabolitos séricos y 5 metabolitos fecales. El efecto de mediación causal promedio correspondiente (ACME), el efecto directo promedio (ADE) y el efecto total se pueden encontrar en la Tabla complementaria S1 en línea (p <0.05).

El análisis de mediación causal reveló posibles metabolitos fecales y séricos que median en la relación causal entre las hormonas y los microbios intestinales. Líneas azules, coeficiente negativo; Líneas rojas, coeficiente positivo. Las flechas pasan de los metabolitos al género bacteriano y las hormonas, y del género bacteriano y las hormonas a los metabolitos implican la concepción de que esos indicadores se afectan entre sí en la dirección representada. corticosterona CORT, hormona liberadora de tirotropina TRH, tiroxina tT4.

Serum LysoPE (0: 0/22: 2 (13Z, 16Z)), PC (16: 0/3: 0), 1,3E, 6Z, 9Z-Nonadecatetraene podría mediar el efecto negativo de TRH en [Prevotella] y fecal El 3-(2,4-ciclopentadien-1-ilideno)-5alfa-androstan-17beta-ol podría mediar el efecto positivo de la TRH en Aerococcus. El cadineno sérico, LysoPE (0: 0/22: 5 (4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z)) y el éster etílico del ácido palmitoleico podrían mediar en la influencia negativa de tT4 en Kaistobacter. La oximesterona fecal podría mediar el efecto negativo de CORT sobre Parabacteroides y la influencia negativa de CORT sobre Aerococcus podría estar mediada por 3-(2,4-ciclopentadien-1-ilideno)-5alfa-androstan-17beta-ol.

La influencia negativa de [Prevotella] y la influencia positiva de Aerococcus sobre la TRH fueron mediadas por el mismo metabolito fecal: el antibiótico X 14889C. Fecal Pro Val Asn Arg podría mediar el efecto negativo de Kaistobacter en tT4. El ácido de lovastatina fecal (ácido mevinolínico) podría mediar el efecto negativo de Aerococcus en CORT.

La alteración de la respuesta neuroendocrina ocurrió después de la exposición a gran altitud por encima de los 5000 m. Nuestro estudio mostró que el eje HPA se activa significativamente y que la TRH y la tT4 del eje HPT se inhibieron en ratas macho con exposición aguda a grandes alturas, lo que es consistente con estudios previos7,19,20. La disfunción neuroendocrina asociada con el estrés por hipoxia aguda puede actuar como desencadenante de la disminución del apetito21.

Además, la exposición aguda a la hipoxia conduce a cambios en la permeabilidad de la barrera intestinal22 y la composición de la microbiota intestinal23, lo que da como resultado una mala adaptación del huésped a la gran altitud y la incidencia de AMS24. También se encontró un aumento de Parabacteroides, Akkermansia, Lactobacillus, Bacteroides y una disminución de Prevotella en modelos humanos y animales de exposición a AHH25,26,27,28. Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas, Lactobacillus, Phascolarctobacterium y Akkermansia son bacterias comensales intestinales, la mayoría de las cuales son bacterias productoras de AGCC28,29,30. Nuestros resultados mostraron que estaban enriquecidos en el grupo de hipoxia. Un estudio anterior encontró que una mayor abundancia de Prevotella se ha demostrado que está involucrada en los síntomas graves de AMS24. Prevotella participó en la regulación del metabolismo31 y la inmunidad32. Combinado con el contexto, se puede sugerir que los cambios adaptativos en la flora intestinal bajo la exposición aguda a la hipoxia pueden contribuir a la adaptación a la hipoxia.

La evidencia acumulada apunta hacia la interacción entre el perfil composicional y funcional de las comunidades bacterianas intestinales y la homeostasis neuroendocrina33,34,35. Nuestro estudio sugirió que TRH y tT4 pueden asociarse con [Prevotella] y Kaistobacter a través de metabolitos de lípidos séricos, incluidos LysoPE (0: 0/22: 2 (13Z, 16Z)) (glicerofosfolípidos), PC (16: 0/3: 0) ( glicerofosfolípidos), 1,3E,6Z,9Z-nonadecatetraeno (acilos grasos), cadineno (lípidos de prenol), LysoPE (0:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)) (glicerofosfolípidos) y palmitoleico Éster etílico de ácido (acilos grasos). Estudios previos habían encontrado que el género Prevotella estaba relacionado con la homeostasis tiroidea periférica, aumentada en el hipertiroidismo y disminuida en el hipotiroidismo35. Las pruebas habían demostrado la asociación entre la TRH y los lípidos36,37, y nuestro hallazgo indicó que la TRH y la tT4 se correlacionaban con los lípidos séricos. Prevotella spp. intestinal, un género bacteriano muy abundante en el intestino, puede potenciar la pérdida de peso y disminuir los niveles de colesterol31. Prevotella_9 y Prevotellaceae_NK3B31_group se correlacionaron positivamente de forma significativa con los metabolitos de glicerofosfolípidos38. LysoPE(0:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)) es un lisofosfolípido (LPL) común que puede tener una función de transducción de señales39. Nuestro estudio mostró que puede servir como mediador para mediar el efecto negativo bidireccional entre tT4 con Kaistobacter. Esos resultados pueden indicar que los metabolitos de los lípidos séricos pueden participar en el metabolismo de los lípidos y actuar como una molécula de señalización para mediar el efecto de la TRH en [Prevotella] y la tT4 en Kaistobacter. Además, el eje HPT posiblemente esté influenciado por la composición de la microbiota intestinal. Algunos estudios han sugerido que la composición microbiana intestinal puede afectar el metabolismo de la yodotironina40,41,42. Si y cómo la composición microbiana afecta el eje HPT sigue siendo una pregunta compleja y redundante. Aunque nuestro estudio sugiere que los microbios intestinales pueden afectar la TRH y la tT4 a través de los metabolitos fecales, muestra pocos efectos de la hipoxia aguda sobre las hormonas efectoras en el eje HPT40. Los cambios en la composición de la microbiota intestinal pueden afectar el metabolismo de las T4 y T3 periféricas a través de metabolitos derivados de microbios, lo que limitó el efecto de la TRH inhibida sobre las T4 y T3 periféricas bajo exposición a hipoxia aguda35,40,43.

La alteración de la flora intestinal está íntimamente ligada a la activación del eje HPA. La comunicación entre diversas alteraciones de la microbiota intestinal y la disfunción del eje HPA está estrechamente relacionada con otros sistemas, como la inmunidad, la barrera intestinal y la barrera hematoencefálica, los metabolitos microbianos y las hormonas intestinales, etc44. El aumento de la actividad del eje HPA conduce a una mayor permeabilidad de la barrera intestinal y cambios en la composición de la microbiota intestinal, mientras que la microbiota intestinal también conduce a la activación del eje HPA a través de metabolitos derivados de microbios y factores de inflamación45. Nuestra investigación sugiere que la mayoría de los metabolitos fecales median la correlación entre Aerococcus con TRH y CORT. Aerococcus, un patógeno que puede inducir inflamación46, se enriqueció significativamente en el grupo de hipoxia y se asoció con cuatro metabolitos fecales. El ácido de lovastatina, un inhibidor de la hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa altamente eficaz47, es un inhibidor de la síntesis de colesterol48. Estos resultados también sugieren que Aerococcus puede interactuar con los metabolitos de esteroides fecales para participar en la activación y regulación del cortisol en condiciones de hipoxia.

Además, se encontró que Parabacteroides está influenciado por CORT a través de los metabolitos fecales oximesterona (esteroide). Los parabacteroides son bacterias antiinflamatorias que producen acetato30, que se eleva significativamente con la exposición a la hipoxia aguda. La abundancia de Parabacteroides está significativamente correlacionada negativamente con la CORT49 sérica. Varios estudios encontraron que la oximesterona, un derivado de esteroides, suprimió selectivamente la inactivación de glucocorticoides dependiente de 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa 2 (11β-HSD2) y se unió competitivamente al sitio de oxidación de cortisol de 11β-HSD250, lo que condujo a la activación del receptor de mineralocorticoides (MR) . Nuestros resultados sugirieron además que Parabacteroides puede verse influenciado por CORT a través de Oximesterona bajo exposición a hipoxia aguda.

Hay varias limitaciones en este estudio. En primer lugar, el análisis de CMA solo sugiere el objetivo y la dirección de la asociación potencial entre la microbiota, los metabolitos y el neuroendocrino para el estudio posterior, en lugar de una relación causal certificada, que aún debe verificarse más mediante experimentos funcionales. En segundo lugar, el estudio solo incluyó la fase aguda de la exposición a gran altitud, lo que preocupa sobre la relación potencial de la flora intestinal y la respuesta neuroendocrina de AMS. Se necesita más investigación adicional para la exposición crónica a la hipoxia. En tercer lugar, como estudio exploratorio preliminar, el tamaño de muestra utilizado en este estudio es de 6/grupo, y las conclusiones son más especulativas. Todavía se necesitan estudios experimentales funcionales posteriores para la verificación.

En resumen, el presente estudio enfatizó la disfunción del eje HPA y las hormonas del eje HPT, la alteración de la microbiota intestinal y los metabolitos fecales y séricos alterados en ratas macho Sprague-Dawley a una altitud simulada de 5500 m. La asociación bidireccional entre los microbios intestinales con TRH, tT4 y CORT a través de múltiples metabolitos séricos y fecales puede desempeñar un papel clave en la adaptación a la hipoxia. Sin embargo, este estudio exploró los metabolitos mediadores de la interacción entre la microbiota neuroendocrina e intestinal a través de la combinación de microbioma y metabolómica utilizando análisis de mediación causal, y se necesita una gran cantidad de estudios para confirmar aún más los resultados de este estudio.

Todos los procedimientos experimentales con ratas fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín (Aprobación No. ACUC-A02-2022-039) y se realizaron de acuerdo con la guía para la revisión ética del bienestar animal (GB /T 35892-2018). Se alojaron ratas macho Sprague-Dawley libres de patógenos específicos (SPF) (Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.), de 10 semanas de edad, en una habitación para animales con un ciclo de luz y oscuridad de 12:12, temperatura de 20 ± 4 °C y humedad del 30 al 60 %. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

Después de 1 semana de preadaptación, las ratas se separaron aleatoriamente en dos grupos. El grupo de hipoxia (n = 6) se colocó en una cámara de oxígeno hipobárico (FLYDWC50-IC) que imita una altitud de 5500 m (379 mmHg), mientras que el grupo de control (n = 6) se mantuvo en un ambiente normóxico (Beijing, China 52 m, 760 mmHg). Las ratas recibieron comida murina normal (300 g/d/jaula, 3,44 kcal/g; 12,95 % kcal de grasa; Beijing Keao Xieli Feed Co., LTD.) y la cámara se abrió durante 20 minutos por día para agregar comida murina y agua. y registre el peso corporal y la ingesta total de alimentos de cada grupo. Después de 3 días de exposición a hipoxia y normoxia, se utilizó pentobarbital sódico al 3% para anestesia profunda, y las heces terminales rectales se extrajeron inmediatamente del abdomen y se congelaron inmediatamente a -80 °C. La muestra de sangre arterial del ventrículo izquierdo se recogió a las 9:00 am. El suero se separó y almacenó a -80 °C hasta que se analizó.

Niveles séricos de hormona liberadora de tirotropina (TRH, CSB-E08040r), TSH (CSB-E05115r), tT4 (CSB-E05082r), fT4 (CSB-E05079r), tT3 (CSB-E05085r), fT3 (CSB-E05076r), la hormona liberadora de corticotropina (CRH, CSB-E08038r), la hormona adrenocorticotrópica (ACTH, CSB-E06875r), la corticosterona (CORT, CSB-E07014r) se analizaron mediante el kit ELISA de Cusabio Biotech Co, Ltd. Todas las hormonas se detectaron siguiendo las pautas del fabricante. .

El ADN total de la muestra fecal (250 mg) se extrajo con el kit QIAamp® PowerFecal DNA (QIAGEN, Alemania). Para analizar la composición taxonómica de la comunidad bacteriana se seleccionaron los cebadores bacterianos universales 16S V4 (338F y 806R) para la posterior pirosecuenciación. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo con Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Se utilizó el kit de preparación de muestras sin PCR de ADN TruSeq® (Illumina, Estados Unidos) para la construcción de bibliotecas siguiendo las recomendaciones del fabricante y se agregaron códigos de índice. La calidad de la biblioteca se evaluó con el fluorómetro Qubit@ 2.0 (Thermo Scientific) y el sistema Agilent Bioanalyzer 2100. Por último, se utilizó el HiSeq2500 PE250 para la secuenciación en la máquina y se generaron lecturas de extremos emparejados de 250 pb.

Se asignaron lecturas emparejadas a las muestras en función de su código de barras único y se truncaron cortando el código de barras y la secuencia del cebador y se fusionaron mediante FLASH (V1.2.7). El filtrado de calidad en las etiquetas sin procesar se realizó en condiciones de filtrado específicas para obtener etiquetas limpias de alta calidad utilizando el software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME, V1.9.1). En resumen, (i) cortar las etiquetas sin procesar con valores continuos de baja calidad (umbral ≤ 19) alcanzar una longitud establecida (umbral ≥ 3); (ii) filtrar las Etiquetas cuya longitud base continua de alta calidad sea inferior al 75 % de la longitud de las Etiquetas; (iii) eliminar la secuencia quimérica a través del Algoritmo UCHIME y Gold Database. Luego, las secuencias filtradas se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) de acuerdo con secuencias representativas utilizando el software Uparse (V7.0.1001) con un umbral de similitud de secuencia del 97 % y se clasificaron en los niveles de filo, familia y género contra la base de datos Greengenes.

Después de volver a muestrear y normalizar las OTU en función de la profundidad de secuenciación mínima (29416), se utilizó la diversidad alfa para analizar la complejidad de la diversidad de especies a través de cinco índices, incluidos Shannon, Chao 1, especies observadas, PD_whole_tree y Simpson. La diversidad beta se calculó después de que la matriz OTU se normalizara mediante el escalado de suma acumulativa (CSS) por QIIME51, y el gráfico se realizó con R (V4.1.3) con el paquete "vegano". Se realizó un análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe)18 para explorar las características microbianas de los grupos hipóxicos y normóxicos, y la puntuación LDA fue 3.

Se mezclaron gránulos fecales (60 mg) y suero (100 μL) con L-2-clorofenilalanina, C-17 y metanol para extraer el sobrenadante para el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Se utilizó un sistema ACQUITY UHPLC (Waters Corporation Milford, EE. UU.) junto con un sistema AB SCIEX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Framingham, MA) para analizar el perfil metabólico en los modos de ionización por electrospray (ESI) positivo y ESI negativo. Se empleó una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm) en modo positivo y negativo.

Los datos sin procesar de LC-MS adquiridos se analizaron con el software Progenesis QI (Waters Corporation Milford, EE. UU.) usando los siguientes parámetros. La tolerancia del precursor se fijó en 5 ppm, la tolerancia de fragmentos se fijó en 10 ppm y la tolerancia del tiempo de retención (RT) se fijó en 0,02 min. Los parámetros de detección del patrón interno se anularon para la alineación de la RT máxima, los picos isotópicos se excluyeron para el análisis, el nivel de eliminación de ruido se fijó en 10:00 y la intensidad mínima se fijó en el 15 % de la intensidad máxima base. La matriz resultante se redujo aún más eliminando cualquier pico con valores faltantes (intensidad de iones = 0) en más del 60 % de las muestras. El estándar interno se utilizó para el control de calidad de los datos (reproducibilidad). Los datos positivos y negativos se combinaron para obtener datos combinados que se importaron al paquete de software SIMCA (V14.0, Umetrics, Umeå, Suecia). Se realizaron análisis de componentes principales (PCA) y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (ortogonales) ((O)PLS-DA) para visualizar las alteraciones metabólicas entre los grupos. Se aplicó la validación cruzada predeterminada de 7 rondas con 1/séptimo de las muestras excluidas del modelo matemático en cada ronda para evitar el sobreajuste. La región T2 de Hotelling, que se muestra como una elipse en los gráficos de puntuación de los modelos, define el intervalo de confianza del 95 % de la variación modelada. La importancia de la variable en la proyección (VIP) clasifica la contribución general de cada variable al modelo OPLS-DA. Los metabolitos diferenciales se seleccionaron en función de un umbral estadísticamente significativo de VIP > 1 y un valor de p inferior a 0,05 a partir de una prueba t de Student de dos colas en las áreas de pico normalizadas. Sobre la base de la base de datos KEGG52, los metabolitos diferenciales se sometieron a un análisis de enriquecimiento de vías y los metabolitos diferenciales se mapearon en la base de datos KEGG utilizando el ID de KEGG. El valor P inferior a 0,05 es una vía significativamente enriquecida.

La prueba t de Student no pareada para el peso corporal, CRH, ACTH, CORT, TRH, TSH, tT4, tT3, fT4 y fT3, y la prueba de Mann Whitney para Shannon, Chao 1, especies observadas, PD_whole_tree y la prueba de Simpson se realizaron con Prism 7 (GraphPad, San Diego, CA), y representado como media ± error estándar (SEM), con el criterio de significación de p < 0,05 para la prueba de dos colas.

Los paquetes de R "stats" y "mediate" se utilizaron para el análisis de regresión y CMA53. Examinamos si los metabolitos fecales o séricos (Mediador, M) median el efecto mediador causal entre las bacterias intestinales y las hormonas séricas. La variable incluida en los modelos de mediación causal debe cumplir con los cuatro supuestos principales utilizando el modelo lineal generalizado (GLM). Los cuatro supuestos incluyen (1) X puede predecir significativamente Y (Y = β0 + β1X + e1), (2) X puede predecir significativamente M (M = β0 + β2X + e2), (3) M predecirá significativamente Y (Y = β0 + β3M + β4X + e3) mientras se ajustaba X, (4) se debilitó la relación entre X e Y controlando por M. Se controló el tratamiento de la hipoxia o la normoxia como variables de ajuste en GLM. Además, estimamos el efecto de mediación causal promedio (ACME, β2 × β3), el efecto directo promedio (ADE, β4) y el efecto total (β1) utilizando el paquete mediate. El valor P inferior a 0,05 es una correlación significativa.

Los conjuntos de datos de secuencia generados durante el estudio actual están disponibles en la base de datos SRA con el código de acceso PRJNA934696.

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Este trabajo fue apoyado por CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (No. 2022-I2M-JB-003).

Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas, Escuela de Medicina Básica, Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Beijing, 100005, China

Jianan Wang, Shiying Liu, Yalei Xie y Chengli Xu

Centro de Ciencias Ambientales y de la Salud, Academia China de Ciencias Médicas, Beijing, 100005, China

Chengli Xu

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CX diseñó los experimentos y revisó críticamente todo el contenido. JW realizó el análisis e interpretación de los datos, redacción y edición del artículo. SL redactó el artículo y revisó críticamente el contenido intelectual importante. YX llevó a cabo los experimentos y recolectó las muestras. Todos los autores habían leído y aprobado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Chengli Xu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Wang, J., Liu, S., Xie, Y. et al. Análisis de asociación de microbiota intestinal-metabolitos-cambios neuroendocrinos en ratas macho exposición aguda a una altitud simulada de 5500 m. Informe científico 13, 9225 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35573-y

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Recibido: 22 noviembre 2022

Aceptado: 20 de mayo de 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35573-y

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