epigenoma espacial

Nature, volumen 616, páginas 113–122 (2023)Citar este artículo

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Las tecnologías espaciales emergentes, incluidas la transcriptómica espacial y la epigenómica espacial, se están convirtiendo en herramientas poderosas para la elaboración de perfiles de estados celulares en el contexto de los tejidos1,2,3,4,5. Sin embargo, los métodos actuales capturan solo una capa de información ómica a la vez, lo que excluye la posibilidad de examinar la relación mecanicista a través del dogma central de la biología molecular. Aquí, presentamos dos tecnologías para el perfilado conjunto del epigenoma y el transcriptoma con resolución espacial, en todo el genoma, mediante la cosecuenciación de la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica, o modificaciones de histonas (H3K27me3, H3K27ac o H3K4me3) y la expresión génica en la misma sección de tejido casi al mismo tiempo. resolución de una sola celda. Estos se aplicaron al cerebro de ratón embrionario y juvenil, así como al cerebro humano adulto, para mapear cómo los mecanismos epigenéticos controlan el fenotipo transcripcional y la dinámica celular en el tejido. Aunque se identificaron características de tejido altamente concordantes por epigenoma espacial o transcriptoma espacial, también observamos patrones distintos, lo que sugiere sus roles diferenciales en la definición de estados celulares. La vinculación del epigenoma con el transcriptoma píxel por píxel permite descubrir nuevos conocimientos sobre el cebado epigenético espacial, la diferenciación y la regulación génica dentro de la arquitectura del tejido. Estas tecnologías son de gran interés en las ciencias de la vida y la investigación biomédica.

La multiómica unicelular permite descubrir los mecanismos de regulación génica en diferentes capas ómicas6,7,8,9 pero carece de información espacial, que es crucial para comprender la función celular en el tejido. La epigenómica espacial, la transcriptómica y la proteómica surgieron recientemente1,2,3,4,5 pero la mayoría de estos pueden capturar solo una capa de la información ómica. Aunque los métodos computacionales pueden integrar datos de múltiples ómicas10, no pueden descubrir fácilmente los vínculos mecánicos entre diferentes capas de ómicas. Anteriormente, desarrollamos códigos de barras deterministas en tejido para la secuenciación ómica espacial para la medición del transcriptoma y un panel de proteínas1 con resolución espacial, y recientemente también se realizó en la plataforma 10X Visium11. En este documento, para investigar más a fondo los mecanismos epigenéticos que subyacen a la regulación de la expresión génica, desarrollamos una combinación espacialmente resuelta del epigenoma y el transcriptoma en todo el genoma mediante el perfilado simultáneo de la accesibilidad a la cromatina y la expresión del ARN mensajero (ensayo espacial para la cromatina y el ARN accesibles por transposasa mediante secuenciación ( ATAC espacial–RNA-seq)), o modificaciones de histonas y expresión de ARNm (ensayo espacial de escisión bajo objetivos y etiquetado y ARN usando secuenciación (Spatial CUT&Tag–RNA-seq); aplicado a modificaciones de histonas H3K27me3, H3K27ac o H3K4me3) en el mismo sección de tejido a nivel celular a través de cobarding determinista, para integrar la química de space-ATAC-seq3 o space-CUT&Tag2 con la transcriptómica espacial. Aplicamos estas técnicas al cerebro embrionario y juvenil del ratón, así como al hipocampo del cerebro humano adulto, para diseccionar los estados epigenéticos y transcripcionales y su papel en la regulación de la dinámica de los tipos de células en el tejido. Este trabajo abre nuevas fronteras en la ómica espacial y puede brindar oportunidades sin precedentes para la investigación biológica y biomédica.

ATAC–RNA-seq espacial se muestra esquemáticamente en la Fig. 1a y Datos extendidos en la Fig. 1a–c. Una sección de tejido congelado se fijó con formaldehído y se trató con un complejo de transposición Tn5 precargado con un adaptador de ADN que contiene un enlazador de ligadura universal que se puede insertar en loci de ADN genómico accesible por transposasa. Luego, la misma sección de tejido se incubó con un adaptador de ADN biotinilado que contenía un enlazador de ligadura universal y una secuencia poli-T que se une a la secuencia poli-A de ARNm para iniciar la transcripción inversa (RT) en el tejido. Luego, se colocó un chip de matriz de canales de microfluidos en la sección de tejido para introducir códigos de barras espaciales Ai (i = 1-50 o 100) que se conjugaron covalentemente con el conector de ligadura universal a través de la ligadura con plantilla. A continuación, se utilizó otro microchip con microcanales perpendiculares a la primera dirección de flujo para introducir códigos de barras espaciales Bj (j = 1−50 o 100) que luego se ligaron a los códigos de barras Ai (i = 1−50 o 100), lo que resultó en un código de barras de dos cuadrícula dimensional de píxeles de tejido con códigos de barras espaciales, cada uno definido por la combinación única de códigos de barras Ai y Bj (i = 1-50 o 100, j = 1-50 o 100; píxeles con código de barras, n = 2500 o 10 000). Finalmente, se liberaron fragmentos de ADN genómico y ADN complementario con código de barras después de la reticulación inversa. Los cDNA se enriquecieron con perlas de estreptavidina y los fragmentos de gDNA se retuvieron en el sobrenadante. Las bibliotecas de gDNA y cDNA se construyeron por separado para la secuenciación de próxima generación (NGS). CUT&Tag–RNA-seq espacial se realizó aplicando un anticuerpo contra una modificación de histona específica (H3K27me3, H3K27ac o H3K4me3) a la sección de tejido y luego usando un complejo Tn5-DNA unido a proteína A para realizar CUT&Tag. Los pasos restantes fueron similares a los de ATAC-RNA-seq espacial (Fig. 1a y Extended Data Fig. 1a, d, e), pero dieron como resultado un perfil conjunto espacial de la ocupación y el transcriptoma de modificación de histonas en todo el genoma.

a, Flujo de trabajo esquemático. b, Comparación del número de fragmentos únicos y la fracción de lecturas en picos (FRiP) en ATAC–RNA-seq espacial y CUT&Tag–RNA-seq espacial. c, Distribución de conteo de genes y UMI en ATAC–RNA-seq espacial y CUT&Tag–RNA-seq espacial. Número de píxeles en E13, 2187; en cerebro humano, 2.500; en cerebro de ratón (ATAC), 9.215; en cerebro de ratón (H3K27me3), 9.752; en cerebro de ratón (H3K27ac), 9.370; en cerebro de ratón (H3K4me3), 9.548. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), el primer y tercer cuartil (límites de la caja) y el rango intercuartílico de 1,5 × (bigotes). d, distribución espacial y UMAP de todos los grupos para ATAC, RNA y agrupación conjunta de datos de ATAC y RNA. La superposición de grupos con la imagen del tejido muestra que los grupos espaciales coinciden con precisión con las regiones anatómicas. Tamaño de píxel, 50 µm; barras de escala, 1 mm. e, Mapeo espacial de GAS y expresión génica para genes marcadores seleccionados en diferentes grupos para ATAC y RNA en ATAC-RNA-seq espacial. f, Análisis de pseudotiempo de glía radial a neuronas prematuras posmitóticas visualizadas a nivel espacial. g, mapas de calor que delimitan la expresión génica y GAS para genes marcadores. h, Cambios dinámicos en GAS y expresión génica a lo largo del pseudotiempo.

Realizamos experimentos espaciales ATAC-RNA-seq en embrión de ratón embrionario día 13 (E13) (tamaño de píxel, 50 μm), cerebro de ratón posnatal día 21/22 (P21/22) (tamaño de píxel, 20 μm) e hipocampo de cerebro humano adulto tejido (tamaño de píxel, 50 μm). Para el tamaño de píxel de 50 μm obtuvimos una media de 25 células para el embrión de ratón E101 y entre una y nueve células para el hipocampo humano3. La mayoría de los píxeles de 20 μm contenían de una a tres células por píxel en el cerebro de un ratón juvenil (Fig. 1b complementaria). Usando un esquema de código de barras de 100 × 100, el área de mapeo cubre casi todo el hemisferio de una sección coronal de cerebro de ratón P22. De esta muestra, obtuvimos una mediana de 14,284 fragmentos únicos por píxel, de los cuales el 19% se enriquecieron en las regiones del sitio de inicio de la transcripción y el 26% se ubicaron en los picos (Fig. 1b y Figs. Suplementarias 1a y 2a). Para la porción de ARN, se detectaron un total de 22,914 genes, con un promedio de 1,073 genes y 2,358 identificadores moleculares únicos (UMI) por píxel (ATAC-ARN-seq espacial) (Fig. 1c). Realizamos CUT & Tag–RNA-seq espacial para H3K27me3, H3K27ac y H3K4me3 en cerebros de ratón P21/22 (tamaño de píxel, 20 μm). Con el dispositivo de código de barras 100 × 100 obtuvimos una mediana de 10.644 (H3K27me3), 10.002 (H3K27ac) y 2.507 (H3K4me3) fragmentos únicos por píxel, de los cuales el 12% (H3K27me3), el 17% (H3K27ac) y el 67% (H3K4me3) se superpusieron con las regiones del sitio de inicio de la transcripción y el 12% (H3K27me3), el 21% (H3K27ac) y el 54% (H3K4me3) se ubicaron en picos, respectivamente (Fig. 1b y Figs. Suplementarias 1a y 2a). Para los datos de ARN, se detectaron 25 881 (H3K27me3), 23 415 (H3K27ac) y 22 731 (H3K4me3) genes con un promedio de 2011 (H3K27me3), 1513 (H3K27ac) y 1329 (H3K4me3) genes por píxel (4734 (H3K27me3), 3,580 (H3K27ac) y 2885 (H3K4me3) UMI por píxel, respectivamente (Fig. 1c)). La evaluación de la calidad de los datos para muestras de embrión de ratón, cerebro de ratón P21 y cerebro humano con códigos de barras de 50 × 50 también se incluye en la Fig. 1b, c, Figs complementarias. 1a y 2a–c y tablas complementarias 2 y 3.

Además, las distribuciones de tamaño de inserción de fragmentos de accesibilidad a la cromatina (ATAC-RNA-seq espacial) y modificación de histonas (CUT & Tag-RNA-seq espacial, H3K27me3, H3K27ac o H3K4me3) fueron consistentes con los fragmentos nucleosómicos capturados en todos los tejidos (Fig. 1c complementaria). ,d). El análisis de correlación entre réplicas mostró una alta reproducibilidad (r = 0,98 para ATAC, r = 0,98 para RNA en ATAC–RNA-seq espacial, r = 0,96 para CUT&Tag (H3K27ac), r = 0,89 para RNA en CUT&Tag–RNA-seq espacial; r denota el coeficiente de correlación de Pearson, la figura complementaria 2d, e). El tipo de tejido, la preparación y la calidad pueden influir en las métricas analíticas (Métodos).

ATAC-RNA-seq espacial en embrión de ratón E13 identificó ocho grupos principales de ATAC y 14 grupos de ARN, lo que sugiere que, en esta etapa de desarrollo, la accesibilidad a la cromatina puede no permitir la discriminación de todos los tipos de células definidos por los perfiles transcripcionales. La distribución espacial de estos grupos concuerda con la histología del tejido (consulte la tinción con hematoxilina y eosina de una sección de tejido adyacente en la Fig. 1d y la Fig. 2a de datos ampliados). En los datos de ATAC, el grupo A3 representa el campo ocular embrionario con accesibilidad de cromatina abierta en los loci de genes que incluyen Six6 (Fig. 1d (izquierda) y Fig. 1e). Los grupos A4-A5 están asociados con varios órganos internos en desarrollo. Los grupos A6–A7 cubren el sistema nervioso central (SNC). Para comparar el resultado de ATAC, agregamos los perfiles de accesibilidad de la cromatina en píxeles dentro de órganos específicos y los comparamos con datos de referencia ENCODE E13.5 ATAC-seq específicos de órganos (Fig. 3b complementaria). Además, los picos obtenidos de nuestros datos ATAC espaciales también son consistentes con la referencia ENCODE (Fig. 3c complementaria). Integramos datos ATAC espaciales con datos de RNA-seq12 de una sola célula para la asignación de tipos de células en cada grupo (Datos extendidos Fig. 2c, d). Como era de esperar, la glía radial (células madre/progenitoras neurales) se observó predominantemente en la capa ventricular, y los tipos de células diferenciadas, como las neuronas prematuras posmitóticas y las interneuronas inhibitorias, se enriquecieron en aquellas regiones distantes de la capa ventricular (Datos extendidos Fig. 2d).

Se identificaron genes marcadores específicos del tipo de célula para grupos individuales, y su expresión se infirió a partir de la accesibilidad de la cromatina (Fig. 1e y Datos extendidos, Fig. 2b, e) y se predijo mediante la puntuación de actividad génica (GAS13; Métodos). Sox2, que participa en el desarrollo del tejido nervioso y la formación del nervio óptico14,15, mostró una alta accesibilidad a la cromatina en el campo ocular embrionario y en la capa ventricular que contiene células madre/progenitoras neurales. Pax6 exhibió un patrón espacial similar de accesibilidad a la cromatina. Myt1l, que codifica la proteína similar al factor de transcripción de mielina 1, presentó una señal ATAC más alta en el cerebro embrionario y el tubo neural16. Six6, un gen clave involucrado en el desarrollo del ojo17, mostró el GAS más alto en la región del ojo. Nrxn2, que codifica Neurexin 2, un gen clave en el sistema nervioso de los vertebrados18, estaba ampliamente accesible en la mayoría de las regiones de las células neurales. La accesibilidad en Rbfox3, que codifica el homólogo 3 de fox-1 de la proteína de unión al ARN (un factor de empalme conocido como NeuN)19, se observó en las neuronas19, mientras que Sox1 y Sox2 presentaron accesibilidad a la cromatina enriquecida en la capa ventricular (Fig. 1e y datos extendidos Fig. 2b ). El enriquecimiento específico del tipo de célula de los reguladores del factor de transcripción (TF) también se examinó mediante el análisis ChromVAR20 de desviación en motivos TF (Sox2 y Nfix), e identificó los reguladores TF positivos (Datos extendidos Fig. 2g, h). Observamos que el motivo Sox2 se enriqueció en el grupo A7, de acuerdo con su función en el desarrollo del cerebro embrionario21. El GRAN análisis22 verificó aún más la fuerte concordancia entre las vías reguladoras de genes y la anotación anatómica (Datos extendidos Fig. 2i, j).

Para los datos espaciales de ARN, se identificaron 14 grupos distintos y se caracterizaron por genes marcadores específicos (Fig. 1d (centro) y Datos extendidos Fig. 2f). Por ejemplo, el grupo R10 (Six6) se correlacionó con el ojo embrionario, los grupos R2, R6 y R8 se relacionaron con el SNC y el grupo R7 se asoció con la formación de cartílago. Para evaluar la calidad de los datos, realizamos un análisis de correlación con datos de referencia ENCODE E13.5 RNA-seq específicos de órganos, que mostraron una alta concordancia (Fig. 3a complementaria). También se identificaron genes marcadores específicos del tipo de célula para grupos de ARN individuales; por ejemplo, Mapt (R2) puede funcionar para establecer y mantener la polaridad neuronal23. Epha5 (R6) está involucrado en la guía del axón, mientras que Slc1a3 (R8) está involucrado en la regulación de la neurotransmisión excitatoria en el SNC18. Myh3 (R3) está asociado con la contracción muscular24. Col2a1 (R7), que muestra expresión específica en tejidos cartilaginosos, tiene un papel esencial en el desarrollo normal del esqueleto embrionario18. Los resultados del análisis de vías25 concuerdan con la anotación anatómica (Fig. 4a complementaria).

Se realizó la integración de datos de ARN espacial con datos de organogénesis de ratón scRNA-seq12 para determinar las identidades celulares en cada píxel (Datos extendidos Fig. 2c, d). Observamos que la glía radial, las neuronas prematuras posmitóticas y las interneuronas inhibidoras (grupos R8, R6 y R2) estaban presentes en los mismos grupos principales, como se muestra en el análisis ATAC (grupos A7 y A6), que verificó el uso de información ómica múltiple para obtener más información. identificación robusta del tipo de célula. Intentamos la agrupación conjunta de datos espaciales ATAC y RNA para refinar los patrones espaciales. Se identificó un nuevo grupo neuronal (J10) en el análisis de agrupamiento conjunto, que no se resolvió fácilmente solo con modalidades únicas (Fig. 1d, derecha). Este resultado destaca el valor de utilizar perfiles multiómicos conjuntos para mejorar el mapeo de tipo de celda espacial26.

El coperfilado del epigenoma y el transcriptoma facilita la investigación de la correlación entre los picos accesibles y los genes expresados ​​píxel por píxel en el contexto del tejido. Observamos señales distintas en los potenciadores predichos para algunos genes (Sox2, Pax6 y Sox1) (Datos extendidos Fig. 2e y Fig. 4b complementaria). Por ejemplo, los potenciadores de Sox2 y Pax6 tenían una mayor accesibilidad a la cromatina en los grupos A7 y A3, respectivamente, lo que sugiere sus funciones en estas regiones de tejido en la regulación de la expresión de Sox2 y Pax6. Aunque la distribución espacial del ARN de estos genes se correspondía con su accesibilidad a la cromatina, el nivel de expresión puede diferir significativamente del grado de accesibilidad (Fig. 1e y Datos extendidos, Fig. 2b). Algunos genes marcadores (Pax6, Sox2 y Myt1l) fueron muy accesibles en algunas regiones del cerebro embrionario, pero mostraron una expresión de ARN modesta o baja (Fig. 1e y Datos extendidos Fig. 2b), lo que puede indicar un cebado de linaje10,27 de estos genes en desarrollo del cerebro embrionario. A pesar de una fuerte correlación entre las réplicas (Fig. 2d complementaria), esta observación podría deberse en parte a la profundidad de secuenciación y la sensibilidad de detección de ARN. Sin embargo, estos resultados aún resaltan el potencial para vincular la regulación epigenética de todo el genoma con la transcripción en el contexto del tejido espacial.

Para investigar la relación espaciotemporal entre la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica en el desarrollo embrionario, analizamos la trayectoria de diferenciación desde la glía radial hasta varios tipos de neuronas, como las neuronas prematuras posmitóticas28. El análisis de pseudotiempo29 se realizó bajo el sistema de coordenadas de pseudotiempo ATAC, y las trayectorias de desarrollo se visualizaron directamente en el mapa de tejido espacial (Fig. 1f). La accesibilidad a la cromatina GAS y la expresión génica a lo largo de esta trayectoria mostraron cambios dinámicos en genes marcadores seleccionados (Fig. 1g, h). Como era de esperar, los niveles de expresión de Sox2, Pax6 y otros genes involucrados en el mantenimiento y la proliferación de progenitores (Gene Ontology (GO) Fabp7 a Pax6 en Extended Data Fig. 3a) se redujeron durante la transición a neuronas postmitóticas. La pérdida de accesibilidad a la cromatina en los loci Pax6 y el marcador de glía radial Fabp7 precedió a la regulación negativa de los ARN correspondientes (Fig. 1h). A su vez, los genes involucrados en la identidad neuronal, la axonogénesis y la organización de sinapsis (GO Myt1l a Dnm3 en Extended Data Fig. 3a), como Dcx y Tubb3, mostraron una mayor expresión en el pseudotiempo espacial, pero la accesibilidad a la cromatina en sus loci ya estaba elevada en etapas anteriores. , lo que sugiere el cebado del linaje de estos genes en la expresión10,27. También encontramos una cohorte de genes cuya expresión disminuyó rápidamente durante el pseudotiempo espacial, pero cuya accesibilidad a la cromatina se mantuvo durante todo el pseudotiempo o disminuyó solo en etapas muy tardías. Muchos de estos genes, como Ptprz1, Bcan y Luzp2, son característicos de las células precursoras de oligodendrocitos, y los procesos biológicos GO correspondientes son la regulación negativa de la mielinización y la regulación de la gliogénesis (GO Cp a Sparcl1 en Extended Data Fig. 3a), lo que sugiere que el linaje neuronal podría conservar el potencial de adquirir una identidad de oligodendrocitos incluso cuando ya se haya alejado de la zona ventricular en el cerebro embrionario. El análisis de pseudotiempo de Monocle2 mostró una bifurcación en la accesibilidad de la cromatina pero no en la expresión del ARN; un camino conducía a regiones cercanas a la zona ventricular (píxeles verdes, datos extendidos Fig. 3d, e) y el otro terminaba en regiones distales a la zona ventricular (píxeles azules). En contraste con el camino verde, el camino azul presentó un aumento en la accesibilidad de la cromatina para los genes involucrados en la axonogénesis y la formación de dendritas (Datos extendidos Fig. 3e (recuadro rojo), 3f), lo que sugiere que el estado de cromatina de las células neurales distales al ventrículo corresponde a un estado neuronal más diferenciado. Por lo tanto, nuestro ATAC-RNA-seq espacial se puede utilizar para descifrar el mecanismo de regulación génica y la dinámica espaciotemporal durante el desarrollo del tejido.

Desarrollamos un microchip con 100 microcanales serpenteantes para codificar 100 × 100 o, en total, 10 000 píxeles por sección de tejido y hasta cinco muestras por chip (Fig. 2a, tamaño de píxel de 20 μm). Esto se aplicó a secciones coronales de cerebro de ratón P22 (en bregma 1) para el perfilado conjunto de la accesibilidad a la cromatina con el transcriptoma. En contraste con el cerebro embrionario de ratón E13, encontramos una mayor cantidad de grupos de ATAC (14) en comparación con los grupos de ARN (11), lo que indica una diferenciación terminal de la mayoría de los tipos de células principales en el cerebro juvenil en relación con el del embrión, que consta de muchas células indiferenciadas. o estados celulares multipotentes. La distribución espacial de los grupos estuvo de acuerdo con la anotación anatómica definida por la tinción de Nissl, lo que refleja la realización del cerebro juvenil (Fig. 2b). Además, los grupos espaciales entre ATAC y RNA mostraron concordancia en la asignación de grupos (Fig. 5a complementaria). La accesibilidad a la cromatina de los genes marcadores identificó regiones principales como el cuerpo estriado (Pde10a y Adcy5, marcadores de neuronas espinosas medianas, grupo A1), cuerpo calloso (Sox10, Mbp y Tspan2, marcadores de oligodendroglia, grupo A3), corteza (Mef2c, Neurod6 y Nrn1 , grupos A0 y A4, marcadores de neuronas excitadoras; Cux2, grupo A4) y ventrículo lateral (Dlx1, Pax6, Notch1 y Sox2, marcadores de células progenitoras ependimales/neurales, grupo A11) (Fig. 2e y datos extendidos Fig. 4a, b). El análisis GREAT confirmó que las vías principales se correlacionaban con las funciones de los tejidos en diferentes regiones anatómicas (Fig. 5b, c complementarias). Los grupos de ARN espacial también mostraron expresión génica específica de la región, como cuerpo estriado (Pde10a, grupo R2, neuronas espinosas medianas), cuerpo calloso (Mbp y Tspan2, grupo R5, oligodendroglia) y corteza (Mef2c, grupos R0 y R1, neuronas excitatorias) ( Fig. 2e y datos extendidos Fig. 4a).

a, Diseño de chips microfluídicos para códigos de barras de 100 × 100 con un tamaño de canal de 20 μm. b, distribución espacial y UMAP de todos los grupos para ATAC y RNA en ATAC-RNA-seq espacial de cerebro de ratón. Tamaño de píxel, 20 µm; barras de escala, 1 mm. c, Integración de datos ATAC y datos scATAC-seq30 del cerebro del ratón. d, Integración de datos de ARN y datos de scRNA-seq32 de cerebro de ratón. e, Mapeo espacial de GAS y expresión génica para genes marcadores seleccionados en diferentes grupos para ATAC y RNA en ATAC-RNA-seq espacial. Se puede encontrar una lista de definiciones de abreviaturas en la Tabla complementaria 1.

La integración de datos del atlas de cerebro de ratón ATAC-seq de una sola célula30 con datos espaciales de ATAC-seq facilitó la identificación de todos los tipos de células principales, y luego se usó la transferencia de etiquetas para asignar tipos de células a ubicaciones espaciales donde el estado epigenético puede controlar la formación de tipos de células específicas ( Fig. 2c y datos extendidos Fig. 4c). Por ejemplo, observamos oligodendrocitos inmaduros y oligodendrocitos en el grupo A3 correspondiente al cuerpo calloso. Se encontró una capa delgada de células similares a la glía radial en el ventrículo lateral, neuronas espinosas medianas (D1MSN y D2MSN) en el cuerpo estriado y neuronas inhibidoras en el núcleo septal lateral30 (Datos extendidos Fig. 4c) según la accesibilidad de la cromatina. Además, las subclases de neuronas excitatorias en diferentes capas de la corteza (ITL23GL, Cortex L2/3; ITL4GL, Cortex L4; ITL5GL, Cortex L5; PTGL, Cortex PT; NPGL, Cortex NP; ITL6GL, Cortex L6; CTGL, Cortex CT; y L6bGL, Cortex L6b) fueron claramente identificados31 (Datos ampliados Fig. 4c). La integración de datos de ARN espacial y el scRNA-seq atlas32 del CNS juvenil permitió la visualización de tipos de células transcripcionales dominantes en el tejido (Fig. 2d y Datos extendidos Fig. 4d). Observamos un alto grado de concordancia en la distribución del tipo de célula espacial según lo determinado por ATAC versus ARN, lo que sugiere una congruencia general entre la accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma en la definición de identidades celulares en el tejido. Por ejemplo, células progenitoras intermedias neuronales (SZNBL, incluidas en células similares a la glía radial de scATAC-seq30), oligodendrocitos maduros (MOL, incluidos en oligodendrocitos de scATAC-seq), oligodendrocitos recién formados (incluidos en oligodendrocitos inmaduros de scATAC-seq) y las neuronas espinosas medianas (MSN) mostradas por los datos de ARN se enriquecieron en las mismas regiones identificadas por los datos de ATAC (Datos extendidos Fig. 4c, d). Además, la detección de una capa delgada de SZNBL en el ventrículo lateral y células leptomeníngeas vasculares (VLMC) en las regiones con meninges preservadas demostró una alta resolución espacial para nuestra tecnología en la identificación de células de baja abundancia, incluso con una resolución de casi una sola célula. (para VLMC) (Datos extendidos Fig. 4c,d).

El perfilado conjunto de ATAC y ARN facilita la inferencia del panorama regulatorio de los genes al buscar la accesibilidad máxima correlacionada y la expresión génica. Detectamos 21,417 enlaces significativos de pico a gen entre elementos reguladores y genes objetivo (Datos extendidos Fig. 5c, d). Se encontró que algunos potenciadores potenciales con interacciones de promotores reguladas dinámicamente estaban enriquecidos en grupos específicos como Dlx1 y Sox2 (grupo A11), Tspan2 (grupo A3) y Adcy5 (grupo A1) (Datos extendidos Fig. 4b), lo que indica la capacidad de espacial ATAC–RNA-seq para identificar las regiones reguladoras clave de los genes diana. Los patrones espaciales del enriquecimiento del motivo TF (Dnajc21, Pax6, Sox2, Sox4 y Mef2c) proporcionaron más información sobre los reguladores TF33 visualizados en el tejido (datos extendidos Fig. 5a, b). Por ejemplo, Sox2 se examinó simultáneamente para determinar la accesibilidad a la cromatina, la expresión génica, los potenciadores putativos y el enriquecimiento del motivo TF, lo que permitió una comprensión más completa de la dinámica de regulación génica. Como se observó en el cerebro embrionario del ratón, algunos genes marcadores con accesibilidad a la cromatina abierta (Sox10, Sox2, Neurod6, Pax6 y Notch1) no se expresaron o se expresaron poco (Fig. 2e y Extended Data Fig. 4a). También se realizó un experimento de réplica biológica en el cerebro del ratón P21 (Datos extendidos Fig. 6; tamaño de píxel de 20 μm, códigos de barras de 50 × 50). Muchos de estos genes codifican factores de transcripción involucrados en el desarrollo neuronal, lo que sugiere la posibilidad de una memoria epigenética, pero no transcripcional, de estos genes en el desarrollo del cerebro.

Además de la accesibilidad a la cromatina, las modificaciones de las histonas también son un aspecto clave de la regulación epigenética. Se realizó CUT&Tag–RNA-seq espacial para co-perfilar transcriptoma y modificaciones de histonas H3K27me3 (loci represores), H3K27ac (promotores activadores y/o potenciadores) o H3K4me3 (promotores activos), respectivamente, en cerebro de ratón P22 (tamaño de píxel de 20 μm). , 100 × 100 códigos de barras). Identificamos 13 y 15 grupos específicos para H3K27me3 y ARN, 12 y 13 grupos para H3K27ac y ARN y 11 y 12 grupos para H3K4me3 y ARN, respectivamente (Fig. 3a-c). Estos grupos coincidieron con la anotación anatómica de la tinción de Nissl y mostraron una buena concordancia entre CUT & Tag y el ARN en patrones espaciales (Fig. 3a-c), lo que fue confirmado por el análisis de Belayer34 (Fig. 7c complementaria).

a–c, Distribución espacial y UMAP de todos los grupos para H3K27me3 y RNA (a), H3K27ac y RNA (b) y H3K4me3 y RNA (c) en cerebro de ratón. Tamaño de píxel, 20 µm; barras de escala, 1 mm. d, Integración de datos H3K27me3 con datos scCUT&Tag (H3K27me3)37 del cerebro del ratón. e, Integración de datos H3K27ac con datos scCUT&Tag (H3K27ac)37 del cerebro del ratón. f, Integración de datos de ARN en CUT&Tag espacial (H3K27me3)–RNA-seq, CUT&Tag espacial (H3K27ac)–RNA-seq y CUT&Tag espacial (H3K4me3)–RNA-seq con datos scRNA-seq32 de cerebro de ratón.

Para H3K27me3, la expresión génica se predijo mediante el cálculo de la puntuación de silenciamiento de la cromatina (CSS2,35; Métodos). CSS alto indica expresión génica reprimida debido a la función de represión transcripcional de H3K27me3. Para H3K27ac y H3K4me3, los genes activos deberían corresponder a GAS2,13 alto (Métodos). La agrupación de CSS o GAS basada en diferentes modificaciones resolvió todas las principales regiones de tejido (Fig. 3a-c y Fig. 6 complementaria) e identificó modificaciones de genes marcadores específicos de la región. Cux2 mostró GAS alto en el grupo C9 (H3K27ac) y el grupo C6 (H3K4me3), lo que indica un enriquecimiento de las neuronas excitatorias5. Cux2 se observó en las capas corticales 2/3, correspondientes a las capas superficiales de la corteza. Por el contrario, H3K27me3 se agotó en Cux2 en la misma región (grupo C3) (Fig. 6 complementaria). GAS de Fezf2 (un gen marcador para la capa cortical 5) fue alto en el grupo C8 (H3K27ac) y el grupo C7 (H3K4me3), correspondientes a la capa más profunda de la corteza. Fezf2 se agotó para H3K27me3 (clúster C1) en esta capa. Satb2 mostró la actividad más alta en los grupos C8 y C9 (H3K27ac) y C6 y C7 (H3K4me3), pero la CSS más baja en los grupos C1 y C3 (H3K27me3) en la capa cortical. Tspan2 se enriqueció en el grupo C4 (H3K27ac) y el grupo C1 (H3K4me3) pero se agotó en el grupo C5 (H3K27me3) en el cuerpo calloso, asociado con el desarrollo del linaje de oligodendrocitos (Fig. 6 complementaria). Los grupos de ARN correspondientes también mostraron firmas específicas de la región concordantes (Fig. 3a-c y Fig. 6 complementaria), como lo ejemplifica Cux2 en las neuronas excitatorias de la capa cortical 2/3 (grupo R5 (H3K27me3 emparejado), grupo R5 (H3K27ac emparejado) y grupo R6 (H3K4me3 emparejado)), Fezf2 en la capa cortical 5 neuronas excitatorias (grupo R1 (H3K27me3 emparejado), grupo R1 (H3K27ac emparejado), grupo R1 (H3K4me3 emparejado)), Tspan2 en células de linaje de oligodendrocitos en el cuerpo calloso (grupo R4 (H3K27me3 emparejado), clúster R4 (H3K27ac emparejado) y clúster R3 (H3K4me3 emparejado) Figura complementaria 6).

La integración y la incorporación conjunta de datos espaciales CUT&Tag y scCUT&Tag36,37 (Fig. 3d,e y Extended Data Fig. 7a) mostraron que los estados epigenéticos en nuestros datos para H3K27me3, H3K27ac y H3K4me3 coincidían con la proyección correspondiente en scCUT&Tag. La integración con el scRNA-seq atlas32 del SNC juvenil correspondiente permitió la transferencia de etiquetas para asignar tipos de células transcripcionales a la ubicación espacial de identidades/estados epigenéticos (Datos extendidos Fig. 7g, h, abajo). Por ejemplo, observamos un enriquecimiento de MOL dentro del cuerpo calloso, una capa delgada de células ependimarias en el ventrículo lateral, neuronas excitatorias en la corteza cerebral y MSN en el cuerpo estriado. También integramos datos de ARN emparejados con el scRNA-seq atlas32 para identificar los tipos de células transcripcionales dominantes a través de la transferencia de etiquetas (Fig. 3f y Datos extendidos Fig. 7b-h). MOL, una capa delgada de células ependimales, MSN y neuronas excitatorias se enriquecieron en las mismas regiones espaciales identificadas por CUT&Tag (H3K27ac y H3K4me3) (Datos extendidos Fig. 7g, h, arriba). En particular para H3K27me3 espacial, mientras que la integración con scCUT&Tag no pudo mostrar claramente la identidad de varios grupos en las modalidades epigenómicas (grupos C0, C1 y C3), la transferencia de etiquetas de datos scRNA-seq con datos de ARN emparejados de la misma sección de tejido mostró claramente identidades de células en estos grupos (Fig. 3a, d y Datos extendidos Fig. 7f), destacando el poder de combinar CUT&Tag y RNA-seq (Spatial CUT&Tag–RNA-seq) en la misma sección de tejido para identificar con mayor precisión tipos o estados celulares . Para inferir directamente las interacciones entre la expresión génica de todo el genoma y los potenciadores correspondientes en todos los grupos, identificamos un total de 19,468 enlaces significativos de pico a gen de CUT & Tag espacial (H3K27ac) – RNA-seq (Suplementario Fig. 7a, b). También se realizó una réplica biológica en el cerebro del ratón P21 (Datos extendidos Fig. 8; tamaño de píxel de 20 μm, códigos de barras de 50 × 50).

Para comprender mejor la regulación epigenética espacial de la expresión génica a escala del genoma, comparamos el GAS o CSS obtenido de ATAC y CUT&Tag (H3K27me3, H3K27ac y H3K4me3) con la expresión de ARN correspondiente en todas las principales regiones de tejido del cerebro del ratón P22 (Fig. 4a-c y las figuras complementarias 9a, 10a y 11a). Por ejemplo, en el cuerpo calloso abundante en oligodendrocitos, observamos una fuerte anticorrelación entre H3K27me3 y el ARN (Fig. 4a). Genes como Mal, Mag y Car2 con baja CSS y alta expresión de ARN corresponden a procesos biológicos de GO, como la mielinización y la regulación de la diferenciación de oligodendrocitos (Datos extendidos Fig. 9a-c y Fig. 8 complementaria; GO para el cuadrante IV). Por el contrario, genes como Grin2b y Syt1 con alta CSS y baja expresión de ARN están relacionados con procesos neuronales como la transmisión sináptica y la liberación de neurotransmisores (Datos extendidos Fig. 9d, e y Fig. 8 complementaria; GO para el cuadrante II). Estos resultados están de acuerdo con el análisis ATAC/H3K27me3/H3K27ac Nano-CUT&Tag37 de la diferenciación oligodendroglial en el cerebro juvenil, que mostró dos ondas de represión H3K27me3 durante este proceso37. También encontramos un pequeño subconjunto de genes (Fig. 4a y Fig. 8 suplementaria; GO para el cuadrante I) con niveles más altos de H3K27me3 y ARN en el cuerpo calloso, como Ptprz1, un marcador de células precursoras de oligodendrocitos38,39 (Extended Datos Fig. 9g), lo que podría indicar el equilibrio transcripcional de algunos de estos genes. Esto también podría deberse en parte a la presencia en la proximidad de células precursoras de oligodendrocitos (que expresan Ptprz1) y oligodendrocitos maduros (donde se reprime Ptprz1) en el cuerpo calloso. Realizamos un análisis de correlación similar para el ARN y H3K27me3 en otras regiones del cerebro juvenil, incluido el estriado y las capas corticales superficiales y más profundas (Figuras complementarias 9a, 10a y 11a). También observamos una fuerte anticorrelación con una cohorte de genes involucrados en procesos neuronales que se activan o reprimen de una manera específica de la región. Por ejemplo, en la capa cortical superficial, los genes para la regulación GABAérgica de la transmisión sináptica se enriquecieron en H3K27me3, mientras que los genes de transmisión de la sinapsis glutamatérgica tenían una expresión alta y H3K27me3 bajo (Figuras complementarias 9b, 10b y 11b; GO para el estriado, las capas corticales superficiales y más profundas). ). A diferencia del cuerpo calloso, en estas regiones solo se encontró un número limitado de genes positivos tanto para H3K27me3 como para ARN. A pesar de una anticorrelación general entre la expresión de ARN y la deposición de H3K27me3, también observamos diferencias regionales (columnas sombreadas en azul en la Fig. 4d); Nav3 y Sncb, con niveles bajos de H3K27me3 tanto en la corteza como en el cuerpo estriado, se expresaron en el primero pero no en el último (Datos extendidos Fig. 9h). Se observó el patrón opuesto para genes como Ablim2 y Gng7 (Datos extendidos Fig. 9h). Car2, un gen marcador expresado en oligodendrocitos y abundante en el cuerpo calloso, presentó ocupación H3K27me3 en las capas corticales, en contraste con el cuerpo calloso y, sorprendentemente, el cuerpo estriado (Datos extendidos Fig. 9c). Por lo tanto, otros mecanismos distintos al depósito de H3K27me3 mediado por Polycomb podrían estar involucrados en la represión transcripcional de estos genes en diferentes áreas del SNC.

a–c, correlación de la expresión del gen H3K27me3 CSS y RNA (a), expresión del gen H3K27ac GAS y RNA (b) y expresión del gen H3K4me3 GAS y RNA (c) en el cuerpo calloso. d, gráfico alterado de la expresión del gen H3K27me3 CSS y RNA en el cuerpo estriado y las capas corticales más profundas y superficiales; –, baja CSS o expresión génica; +, alto CSS o expresión génica. e, diagramas de Venn que muestran CSS/GAS alto (+) o bajo (-) para diferentes modificaciones de histonas en el cuerpo calloso con genes marcadores de ARN comunes.

Datos fuente

En contraste con H3K27me3, observamos una fuerte correlación entre el ARN y las marcas de activación H3K4me3 o H3K27ac en el cuerpo calloso, con genes altamente expresados ​​y con alta deposición en estas dos modalidades que regulan los procesos en oligodendroglia (Fig. 4b, c y Fig. 12 complementaria ; VAYA para H3K27ac cuadrante I y H3K4me3 cuadrante I). Por ejemplo, Mal mostró la mayor actividad o expresión en el cuerpo calloso para ATAC, H3K27ac, H3K4me3 y ARN emparejado (Datos extendidos Fig. 9a). Gpr88, un gen marcador de MSN, estaba enriquecido en el cuerpo estriado para ATAC, H3K27ac y H3K4me3 pero con CSS bajo en el cuerpo estriado para H3K27me3 (Datos extendidos Fig. 9f). Además, examinamos la regulación colectiva entre diferentes modificaciones de histonas en el cuerpo calloso (Fig. 4e y Figs. Suplementarias 13 y 14). En general, H3K4me3 y H3K27ac mostraron altas correlaciones, con sus señales anticorrelacionadas con H3K27me3 (Fig. 4e). También observamos la coocupación de H3K4me3 o H3K27ac y H3K27me3 en varios loci de genes en esta región de tejido (Fig. 4e y Figs. 13 y 14 complementarias). Estos genes están involucrados en la diferenciación y mielinización de oligodendrocitos y otros procesos como el catabolismo y la localización de proteínas (Figuras complementarias 13 y 14). Algunos de estos genes, como Ptprz1 y Fnbp1, también presentaron niveles más altos de H3K27me3 y ARN (Fig. 4a). Como se mencionó anteriormente, esta posible bivalencia H3K4me3/H3K27me3 puede reflejar un equilibrio transcripcional.

Realizamos ATAC-RNA-seq espacial en la formación del hipocampo del cerebro humano adulto (hombre de 31 años), que es una región cerebral compleja involucrada en funciones cognitivas y enfermedades como la depresión mayor40 y la enfermedad de Alzheimer41. Identificamos siete y ocho grupos principales para ATAC y ARN, respectivamente, y el patrón espacial coincidió con los principales puntos de referencia anatómicos (Fig. 5a) 3, incluidos los genes marcadores específicos (Fig. 5d). El grupo ATAC A4 representa la capa de células granulares (GCL) (THY1, BCL11B) y el grupo A6 corresponde al plexo coroideo (Fig. 5a, d). Los motivos de TF (NEUROD1 y SNAI1) y sus patrones espaciales se visualizaron en diferentes regiones de tejido, y se identificaron reguladores de TF positivos (Datos extendidos Fig. 10b, c). Para los datos de ARN, también detectamos grupos distintos con genes marcadores únicos (Fig. 5a, d) como PROX1 y BCL11B enriquecidos en el grupo R4 (GCL).

a, Imagen de campo claro, distribución espacial y UMAP de todos los grupos basados ​​en ATAC y ARN en el hipocampo humano. ML, capa molecular; Pyr, neuronas piramidales. Tamaño de píxel, 50 μm, barras de escala, 1 mm. b, Integración de nuestros datos ATAC con datos scATAC-seq42 del hipocampo humano. c, Integración de nuestros datos de ARN con datos de snRNA-seq del cerebro humano43. d, Mapeo espacial de GAS y expresión génica para genes marcadores seleccionados en diferentes grupos para ATAC y ARN. Oligo, oligodendrocitos; astro, astrocitos; DG, giro dentado.

También llevamos a cabo la integración de nuestros datos ATAC y datos scATAC-seq de muestras de cerebro humano42 (Fig. 5b), y nuestros datos de ARN con datos de snRNA-seq de cerebro humano adulto43, para mostrar las identidades y estados de las células dominantes. Los tipos de células identificados por snRNA-seq43 se asignaron a cada grupo mediante la transferencia de etiquetas (Fig. 5c y Datos extendidos, Fig. 10a). Se detectaron células granulares (GC) en el GCL, las neuronas del cornu ammonis (CA) se enriquecieron en las regiones CA3-4 y las VLMC se distinguieron fuertemente en el plexo coroideo en comparación con otras regiones.

En general, tanto ATAC como RNA pueden resolver fácilmente todas las características principales de los tejidos en esta región, pero la cosecuenciación espacial del epigenoma y el transcriptoma puede proporcionar nuevos conocimientos sobre el mecanismo dinámico de regulación génica que no se puede realizar mediante modalidades únicas. Por ejemplo, PROX1, un gen característico que define la identidad de las neuronas granulares durante la selección del destino de las neuronas piramidales 44, de hecho se expresa altamente en GCL pero mostró una accesibilidad modesta a la cromatina (Fig. 5d). Esto podría atribuirse a una demanda mínima de síntesis de nuevas transcripciones de PROX1 en células granulares maduras posmitóticas y, por lo tanto, no es necesario para mantener un estado de cromatina abierta activa.

Las tecnologías ómicas espaciales (epigenómica espacial, transcriptómica y proteómica), basadas en NGS1,2,3,4,45,46,47 o en imágenes5,48, ofrecen una oportunidad sin precedentes para generar nuevos y ricos conocimientos sobre la regulación génica en el tejido espacial. contexto. Sin embargo, para comprender de manera integral el mecanismo de regulación génica, se deben perfilar simultáneamente diferentes capas de información ómica. Esto se demostró por primera vez en células individuales disociadas6,7,8,9, pero aún no se ha realizado directamente en el tejido. La hibridación in situ con fluorescencia secuencial de ADN basada en imágenes combinada con la hibridación in situ con fluorescencia secuencial de ARN detectó cromatina espacial y expresión génica para genes diana y loci genómicos seleccionados49. A día de hoy, las tecnologías actuales no han sido capaces de realizar comparaciones imparciales de todo el genoma del epigenoma y el transcriptoma en la misma sección de tejido a nivel celular. Desarrollamos ATAC–RNA-seq espacial y CUT&Tag–RNA-seq espacial (aplicado a H3K27me3, H3K27ac y H3K4me3) para co-perfilar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma o las modificaciones de histonas junto con el transcriptoma completo en la misma sección de tejido en casi resolución de celda única (disponible para navegación espacial, ver 'Disponibilidad de datos'). Estas técnicas se aplicaron para comparar cerebros de ratones embrionarios y juveniles, así como cerebros humanos adultos. La cosecuenciación espacial del epigenoma-transcriptoma produjo dos capas de información ómica espacial directamente en el tejido, con una calidad de datos similar a la obtenida previamente por modalidades únicas. Estas tecnologías nos permiten examinar la dinámica espaciotemporal y los mecanismos de regulación de genes en todo el genoma en el contexto del tejido.

Hemos demostrado ATAC o CUT&Tag junto con RNA para el mapeo multiómico espacial. Podría ser posible combinar los tres (accesibilidad a la cromatina, modificaciones de histonas y transcriptoma) para delinear un panorama más completo de la red de regulación génica en el tejido. También podría ser posible medir simultáneamente múltiples modificaciones de histonas para evaluar el efecto de multivalencia en la regulación de la expresión génica espacial. Previamente, demostramos el perfilado espacial del transcriptoma y un gran panel de proteínas1. Prevemos que es posible y muy valioso combinar aún más el epigenoma, el transcriptoma y el proteoma50 para diseccionar los patrones espaciales del tipo celular, el estado y la regulación génica. Finalmente, la multiómica espacial, como se informa aquí, puede encontrar aplicaciones generalizadas más allá de la neurociencia y la biología del desarrollo. Por ejemplo, múltiples modalidades para el mapeo espacial de tejidos de enfermedades humanas no solo se validan entre sí, sino que también aclaran mejor los mecanismos que impulsan estados celulares anormales que no se pueden discernir fácilmente utilizando métodos de modalidad única. Además, la información espacial puede mostrar aún más cómo el entorno del tejido local afecta el estado, la dinámica y la función celular en todas las capas del dogma central. En este trabajo, desarrollamos un dispositivo con un área de mapeo más grande y un mayor rendimiento que permite el mapeo de un área de tejido cuatro veces más grande, utilizando códigos de barras de 100 × 100 (total 10,000 píxeles, tamaño de píxel de 20 μm) para cubrir casi todo el hemisferio de una sección coronal de cerebro de ratón P22 juvenil. El diseño del canal serpenteante permite el procesamiento simultáneo de cinco muestras de tejido, cada una mapeada para 10 000 píxeles. Es factible aumentar aún más el área de mapeo aumentando la cantidad de códigos de barras y mejorar aún más el rendimiento mediante el manejo automatizado de líquidos.

En resumen, la cosecuenciación del epigenoma y el transcriptoma a nivel celular resuelta espacialmente en todo el genoma representa una de las herramientas más informativas en biología espacial y se puede aplicar a una amplia gama de investigaciones biológicas y biomédicas.

Se adquirieron secciones congeladas sagitales de embrión C57 de ratón (n.º MF-104-13-C57) de Zyagen. Los embriones de ratón E13 recién cosechados se congelaron instantáneamente en compuestos de temperatura de corte óptimos y se seccionaron con un grosor de 7 a 10 μm. Las secciones de tejido se recogieron en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina (Electron Microscopy Sciences, nº 63478-AS).

Se obtuvo tejido de cerebro de ratón juvenil (P21-P22) de la línea de proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) Sox10:Cre-RCE:LoxP en un fondo genético mixto C57BL/6xCD1 mantenido en Karolinska Institutet. La línea se generó primero cruzando animales Sox10:Cre (The Jackson Laboratory, no. 025807) con animales RCE:loxP (eGFP) (The Jackson Laboratory, no. 032037-JAX). Esto fue establecido y mantenido mediante la reproducción de machos que carecían del alelo Cre con hembras que portaban un alelo Cre hemicigótico; el alelo informador se mantuvo en homocigosis o hemicigosis tanto en machos como en hembras. Esto resultó en el etiquetado específico del linaje de oligodendrocitos con eGFP. Todos los animales estaban libres de patógenos bacterianos y virales de ratón, ectoparásitos y endoparásitos. Se mantuvo el siguiente ciclo de luz/oscuridad para los ratones: amanecer, 06:00–07:00; de día, de 07:00 a 18:00; atardecer, 18:00–19:00; noche, 19:00–06:00. Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente en un número máximo de cinco por jaula (IVC sealsafe GM500, tecniplast). Los parámetros generales de alojamiento, incluida la temperatura, la ventilación y la humedad relativa, siguieron el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados con fines experimentales y científicos. La calidad del aire se controló utilizando unidades de tratamiento de aire independientes equipadas con un filtro de aire de partículas de alta eficiencia. La humedad relativa del aire fue consistentemente de 55 ± 10%, a una temperatura de 22 °C. Los parámetros de manejo fueron monitoreados con unidades ScanClime (Scanbur). Las jaulas contenían un refugio de caja de cartón, palos para roer y material para anidar (Scanbur), colocados sobre camas de madera dura (TAPVEI). A los ratones se les proporcionó una dieta de comida regular, y el agua se suministró en una botella de agua y se cambió semanalmente. Las jaulas se cambiaron cada 2 semanas en un gabinete de flujo de aire laminar.

Los ratones se sacrificaron en P21/P22 (se utilizaron ambos sexos) mediante anestesia con ketamina (120 mg kg–1 de peso corporal) y xilazina (14 mg kg–1 de peso corporal), seguido de perfusión transcraneal con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado frío (87 NaCl mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 26 mM, sacarosa 75 mM, glucosa 20 mM, CaCl2*2H2O 1 mM y MgSO4*7H2O 2 mM en H2O destilada). Después del aislamiento, los cerebros se mantuvieron durante un período de tiempo mínimo en líquido cefalorraquídeo artificial hasta que se incrustaron en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura) y se congelaron con una mezcla de hielo seco y etanol. Las criosecciones coronales de 10 μm se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina (n.º 63478-AS, Electron Microscopy Sciences) o portaobjetos de vidrio de 2 × 3 pulgadas cuadradas (AtlasXomics).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo la directiva europea no. 2010/63/EU, directiva sueca local no. L150/SJVFS/2019:9, Saknr no. L150 y Karolinska Institutet directrices complementarias para la adquisición y el uso de animales de laboratorio, no. dr. 1937/03-640. Todos los procedimientos descritos fueron aprobados por el comité local de experimentos éticos en animales de laboratorio en Suecia (Estocolmo Norra Djurförsöksetiska nämnd, n.º 1995/2019 y 7029/2020).

El tejido cerebral humano se obtuvo de la colección de cerebros del Instituto Psiquiátrico del Estado de Nueva York en la Universidad de Columbia, que incluye muestras de cerebro de la República de Macedonia. La recolección de tejido cerebral se llevó a cabo con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Instituto Psiquiátrico del Estado de Nueva York, y se obtuvo el consentimiento informado de los familiares que aceptaron donar los cerebros y participar en las entrevistas de autopsia psicológica.

Analizamos el tejido del hipocampo cerebral de un varón caucásico de 31 años, sin diagnóstico psiquiátrico o neurológico, que había fallecido a causa de un accidente traumático y tenía un alto nivel de funcionamiento global antes de la muerte medido por la puntuación de la escala de evaluación global51, que fue 90 (puntuación de 1 a 100, siendo 100 la función más alta) y con toxicología negativa para medicamentos y drogas psicotrópicas. El intervalo post mortem (tiempo desde la muerte hasta la recolección del cerebro) fue de 6,5 h.

La región anterior del hipocampo se diseccionó de una sección coronal recién congelada (20 mm de espesor) del hemisferio cerebral derecho. Se seleccionó la región de la circunvolución dentada (alrededor de 10 × 10 mm2) de la región anterior del hipocampo. Se recogieron criosecciones de 10 μm en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina (n.º 63478-AS, Electron Microscopy Sciences). Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

La transposasa Tn5 descargada (nº C01070010) y pA-Tn5 (nº C01070002) se adquirieron de Diagenode y el transposoma se montó siguiendo las directrices del fabricante. Los oligos aplicados para el ensamblaje de transposomas fueron:

Tn5ME-A, 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′,

Tn5MErev, 5′-/5Phos/CTGTCTCTTATACACATCT-3′ y

Tn5ME-B, 5′-/5Phos/CATCGGCGTACGACTAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

Los oligos de ADN utilizados para la PCR y la construcción de bibliotecas se muestran en la Tabla complementaria 4. Todas las secuencias de códigos de barras de ADN se proporcionan en las Tablas complementarias 5 y 6 y todos los demás productos químicos y reactivos en la Tabla complementaria 7.

Las fotomáscaras cromadas se compraron en Front Range Photomasks, con un ancho de canal de 20 o 50 μm. Los moldes para dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) se fabricaron mediante fotolitografía estándar. Se siguieron las directrices del fabricante para recubrir por rotación la fotoprotección negativa SU-8 (nº SU-2025 y SU-2010, Microchem) sobre una oblea de silicio (nº C04004, WaferPro). Las alturas de las características eran de aproximadamente 20 y 50 μm para dispositivos de 20 y 50 μm de ancho, respectivamente. Los dispositivos de microfluidos PDMS se fabricaron utilizando los moldes SU-8. Mezclamos los agentes de curado y base en una proporción de 1:10 y vertemos la mezcla en los moldes. Después de desgasificar durante 30 min, la mezcla se curó a 70 °C durante 2 h. El PDMS solidificado se extrajo para su uso posterior. Hemos publicado un protocolo detallado para la fabricación y preparación del dispositivo PDMS52.

Los portaobjetos de tejido congelado se descongelaron durante 10 min a temperatura ambiente. El tejido se fijó con formaldehído (0,2 %, con 0,05 U μl–1 de inhibidor de RNasa) durante 5 min y se inactivó con glicina 1,25 M durante 5 min más. Después de la fijación, el tejido se lavó dos veces con 1 ml de DPBS-RI 0,5x y se limpió con H2O desionizada (DI).

La permeabilización tisular se realizó con 200 μl de tampón de lisis (MgCl2 3 mM, Tween-20 0,01 %, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NP40 0,01 %, NaCl 10 mM, albúmina de suero bovino (BSA) 1 %, digitonina 0,001 % , 0,05 U μl–1 inhibidor de RNasa) durante 15 min y se lavó dos veces con 200 μl de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, BSA al 1 %, Tween-20 al 0,1 %) durante 5 mín. Mezcla de transposición (5 μl de transposoma casero, 33 μl de DPBS 1×, 50 μl de tampón de tagmentación 2×, 1 μl de digitonina al 1 %, 1 μl de Tween-20 al 10 %, 0,05 U μl–1 de inhibidor de RNasa, Se añadieron 10 μl de H2O libre de nucleasas con incubación a 37 °C durante 30 min. A continuación, se añadieron 200 μl de EDTA 40 mM con 0,05 U μl–1 de inhibidor de RNasa con incubación durante 5 min a temperatura ambiente, para detener la transposición. Finalmente, las secciones de tejido se lavaron dos veces con 200 μl de PBS-RI 0,5x durante 5 min y se limpiaron con agua desionizada.

Para RT, se utilizó la siguiente mezcla: 12,5 μl de tampón RT 5x, 4,5 μl de agua libre de RNasa, 0,4 μl de inhibidor de RNasa, 0,8 μl de Superase In inhibidor de RNasa, 3,1 μl de trifosfato de desoxinucleótido 10 mM cada uno, 6,2 μl de Maxima H Minus Reverse Transcriptase, 25 μl de 0,5x PBS-RI y 10 μl de cebador RT. Los tejidos se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente, luego a 42 °C durante 90 min en una caja húmeda. Después de la reacción de RT, los tejidos se lavaron con 1x NEBuffer 3.1 e inhibidor de RNasa al 1% durante 5 min.

Para la ligadura in situ del primer código de barras (código de barras A), el primer chip PDMS se cubrió en la región del tejido de interés. Con fines de alineación, se utilizó un objetivo de 10 aumentos (Thermo Fisher Scientific, microscopio EVOS FL Auto n.º AMF7000, revisión de software EVOS FL Auto 2 2.0.2094.0) para tomar una imagen de campo claro. El dispositivo PDMS y el portaobjetos de tejido se sujetaron firmemente con una pinza acrílica casera. El código de barras A se recoció primero con el enlazador de ligadura 1, 10 μl de enlazador de ligadura 100 μM, 10 μl de cada código de barras A 100 μM y 20 μl de tampón de recocido 2x (Tris 20 mM pH 7,5–8,0, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM ) y mezcle bien. Para cada canal, se prepararon 5 μl de mezcla maestra de ligadura con 2 μl de mezcla de ligadura (27 μl de tampón de ADN ligasa T4, 72,4 μl de agua libre de ARNasa, 5,4 μl de Triton X-100 al 5 %, 11 μl de tampón de ADN T4 ligasa), 2 μl de 1 × NEBuffer 3.1 y 1 μl de cada código de barras de ADN recocido A (A1-A50/A100, 25 μM). Se usó vacío para cargar la mezcla maestra de ligadura en 50 canales del dispositivo, seguido de incubación a 37 °C durante 30 min en una caja húmeda. El chip PDMS y la abrazadera se retiraron después de lavar con 1x NEBuffer 3.1 durante 5 min. El portaobjetos se lavó con agua y se secó al aire.

Para la ligadura in situ del segundo código de barras (código de barras B), se cubrió el portaobjetos con el segundo chip PDMS y se tomó otra imagen de campo claro con el objetivo 10x. Se aplicó una pinza acrílica para sujetar juntos el PDMS y el portaobjetos de tejido. El recocido de los códigos de barras B (B1-B50/B100, 25 μM) y la preparación de la mezcla maestra de ligadura se llevaron a cabo como para los códigos de barras A. El dispositivo se incubó a 37 °C durante 30 min en una caja húmeda. El chip PDMS y la abrazadera se retiraron después de lavar con DPBS 1x con inhibidor SUPERase In RNase durante 5 min. El portaobjetos se lavó con agua y se secó al aire. Luego se tomó una imagen de campo claro para una mayor alineación.

Para la lisis del tejido, la región de interés se digirió con 100 μl de mezcla de entrecruzamiento inverso (0,4 mg ml–1 de proteinasa K, EDTA 1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, SDS al 1 %) a 58 °C. durante 2 h en una caja húmeda. El lisado se recogió en un tubo de 1,5 my se incubó a 65 °C durante la noche.

Para la separación de ADN y ADNc, el lisado se purificó con Zymo DNA Clean & Concentrator-5 y se eluyó con 100 μl de agua libre de ARNasa. El tampón B&W 1x con Tween-20 al 0,05 % se usó para lavar 40 μl de perlas Dynabeads MyOne Streptavidin C1 tres veces. Luego, se usaron 100 μl de tampón 2x ​​B&W con 2,5 μl de SUPERase In RNase inhibitor para resuspender las perlas, que luego se mezclaron con el lisado y se permitió que se unieran a temperatura ambiente durante 1 h con agitación. Se usó un imán para separar las perlas y el sobrenadante en el lisado.

El sobrenadante se eliminó para la construcción de la biblioteca ATAC, luego se purificó con Zymo DNA Clean & Concentrator-5 y se eluyó con 20 μl de agua libre de ARNasa. Se añadió solución PCR (25 μl de 2x NEBNext Master Mix, 2,5 μl de cebador i7 indexado 25 μM, 2,5 μl de cebador P5 PCR 25 μM) y se mezcló bien. Primero se realizó PCR con el siguiente programa: 72 °C por 5 min, 98 °C por 30 s y ciclos a 98 °C por 10 s, 63 °C por 30 s y 72 °C por 1 min, cinco veces. Para determinar ciclos adicionales, la mezcla preamplificada (5 μl) se mezcló con una solución de PCR cuantitativa (qPCR) (5 μl de 2x NEBNext Master Mix, 0,24 μl de 25x SYBR Green, 0,5 μl de 25 μM nuevo cebador P5 PCR , 3,76 μl de H2O libre de nucleasas, 0,5 μl de cebador i7 indexado 25 μM). Luego se realizó la reacción de qPCR con el siguiente programa: 98 °C por 30 s con ciclos a 98 °C por 10 s, 63 °C por 30 s y 72 °C por 1 min, 20 veces. El ADN preamplificado restante (45 μl) se amplificó ejecutando ciclos adicionales según lo determinado por qPCR (para alcanzar un tercio de la señal saturada). El producto final de la PCR se purificó con perlas Ampure XP 1x (45 μl) y se eluyó en 20 μl de H2O libre de nucleasas.

Las perlas se usaron para la construcción de bibliotecas de cDNA. Primero se lavaron dos veces con 400 μl de tampón 1x B&W con Tween-20 al 0,05 % y una vez con Tris 10 mM pH 8,0 que contenía Tween-20 al 0,1 %. Las perlas de estreptavidina con moléculas de ADNc unidas se resuspendieron en una solución de TSO (22 μl de trifosfato de desoxinucleótido 10 mM cada una, 44 μl de tampón Maxima RT 5x, 44 μl de solución de Ficoll PM-400 al 20 %, 88 μl de agua libre de ARNasa, 5,5 μl de cebador de cambio de plantilla 100 uM (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrG+G), 11 μl de Maxima H Minus Reverse Transcriptase, 5,5 μl de RNase Inhibitor). Las perlas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y luego a 42 °C durante 90 min, con agitación suave. Después de lavar las perlas una vez con 400 μl de Tris 10 mM y Tween-20 al 0,1 % y una vez con agua, se resuspendieron en una solución de PCR (110 μl de 2x Kapa HiFi HotStart Master Mix, 8,8 μl de 10 μM cebadores 1 y 2 , 92,4 μl de agua libre de ARNasa). El termociclado por PCR se realizó con el siguiente programa: 95 °C por 3 min y ciclado a 98 °C por 20 s, 65 °C por 45 s y 72 °C por 3 min, cinco veces. Después de cinco ciclos, se retiraron las perlas de la solución de PCR y se añadió 25x SYBR Green a una concentración de 1x. Las muestras se colocaron nuevamente en una máquina qPCR con las siguientes condiciones de termociclado: 95 °C durante 3 min, ciclado a 98 °C durante 20 s, 65 °C durante 20 s y 72 °C durante 3 min, 15 veces, seguido de 5 min a 72 °C. La reacción se eliminó una vez que la señal de qPCR comenzó a estabilizarse. El producto de la PCR se purificó con perlas Ampure XP 0,8x y se eluyó en 20 μl de H2O libre de nucleasas.

Se utilizó un kit de preparación de bibliotecas Nextera XT para la preparación de bibliotecas. El ADNc purificado (1 ng) se diluyó en agua libre de ARNasa hasta un volumen total de 5 μl, luego se agregaron 10 μl de tampón de ADN Tagment y 5 μl de mezcla Amplicon Tagment con incubación a 55 °C durante 5 min; Luego se añadieron 5 μl de tampón NT, con incubación a temperatura ambiente durante 5 min. Se añadió solución maestra de PCR (15 μl de mezcla maestra de PCR, 1 μl de cebador P5 10 μM, 1 μl de cebador P7 indexado 10 μM, 8 μl de agua libre de ARNasa) y se realizó la reacción de PCR con el siguiente programa: 95 ° C por 30 s, ciclado a 95 °C por 10 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 30 s y 72 °C por 5 min, por 12 ciclos. El producto de la PCR se purificó con perlas Ampure XP 0,7x para obtener la biblioteca.

Se utilizó un chip de alta sensibilidad Agilent Bioanalyzer para determinar la distribución de tamaños y la concentración de la biblioteca antes de la secuenciación. La NGS se llevó a cabo en un secuenciador Illumina NovaSeq 6000 (modo de 150 pares de bases emparejado).

El portaobjetos de tejido congelado se descongeló durante 10 min a temperatura ambiente. El tejido se fijó con formaldehído (0,2 %, con 0,05 U μl–1 de inhibidor de RNasa) durante 5 min y se inactivó con glicina 1,25 M durante 5 min más. Después de la fijación, el tejido se lavó dos veces con 1 ml de tampón de lavado (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM pH 7,5, una tableta de cóctel inhibidor de proteasa, espermidina 0,5 mM) y se sumergió en agua DI. La sección de tejido se permeabilizó con tampón de lavado de digitonina NP40 (0,01 % de digitonina, 0,01 % de NP40 en tampón de lavado) durante 5 min. El anticuerpo primario (dilución 1:50 con tampón de anticuerpos (BSA al 0,001 %, EDTA 2 mM en tampón de lavado con digitonina NP40) se añadió con incubación a 4 °C durante la noche. El anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cobaya, 1:50 dilución con tampón de lavado de digitonina NP40) con incubación durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, el tejido se lavó con tampón de lavado durante 5 min. Una dilución 1:100 del complejo adaptador pA-Tn5 en tampón de lavado de 300 (una tableta de cóctel inhibidor de proteasa, NaCl 300 mM, espermidina 0,5 mM, HEPES 20 mM pH 7,5) con incubación a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de un lavado de 5 min con tampón de lavado 300. Tampón de tagmentación (MgCl2 10 mM en 300 (tampón de lavado) con incubación a 37 °C durante 1 h. A continuación, se añadió EDTA 40 mM con 0,05 U μl–1 de inhibidor de RNasa con incubación a temperatura ambiente durante 5 min para detener la tagmentación. El tejido se lavó dos veces con 0,5x DPBS-RI durante 5 min para su uso posterior.

Para RT, dos ligaduras y separación de perlas, los protocolos fueron como para ATAC-RNA-seq espacial. Para la construcción de la biblioteca CUT&Tag, el sobrenadante se purificó con Zymo DNA Clean & Concentrator-5 y se eluyó con 20 μl de agua libre de ARNasa. Se añadió solución de PCR (2 μl de cebador P5 PCR 10 μM y cebador i7 indexado, 25 μl de NEBNext Master Mix) y se mezcló bien. La PCR se realizó con el siguiente programa: 58 °C durante 5 min, incubación a 72 °C durante 5 min y 98 °C durante 30 s, luego ciclado a 98 °C durante 10 s, con incubación a 60 °C durante 10 s 12 veces y una incubación final a 72 °C durante 1 min. El producto de la PCR se purificó con perlas Ampure XP 1,3x usando el protocolo estándar y se eluyó en 20 μl de H2O libre de nucleasas. La construcción de la biblioteca de cDNA siguió el protocolo espacial ATAC-RNA-seq.

Se utilizó un chip de alta sensibilidad Agilent Bioanalyzer para determinar la distribución de tamaños y la concentración de la biblioteca antes de la secuenciación. La NGS se llevó a cabo en un secuenciador Illumina NovaSeq 6000 (modo de 150 pares de bases emparejado).

Para los datos de ATAC y CUT&Tag, se usaron los enlazadores 1 y 2 para filtrar la lectura 2 y las secuencias se convirtieron al formato Cell Ranger ATAC v.1.2 (10X Genomics). Las secuencias del genoma estaban en la lectura 1 recién formada, y los códigos de barras A y B se incluyeron en la lectura 2 recién formada. Se utilizó referencia humana (GRCh38) o referencia de ratón (GRCm38) para alinear archivos fastq. Los fragmentos similares a BED así obtenidos se usaron para realizar análisis aguas abajo. El archivo de fragmentos incluye fragmentos de información sobre ubicaciones espaciales (código de barras A × código de barras B) y el genoma.

Para los datos de ARN, la lectura 2 se refinó para extraer el código de barras A, el código de barras B y el UMI. ST pipeline v.1.7.2 (ref. 53) se usó para mapear la lectura procesada 1 contra el genoma del ratón (GRCm38) o el genoma humano (GRCh38), lo que creó la matriz de genes para el análisis posterior que contiene información sobre genes y ubicaciones espaciales. (código de barras A × código de barras B).

Primero identificamos la ubicación de los píxeles en el tejido de la imagen de campo claro utilizando MATLAB 2020b (https://github.com/edicliuyang/Hiplex_proteome).

Signac v.1.8 (ref. 54) se cargó en R v.4.1. Las matrices ATAC, CUT&Tag y RNA se leyeron en Signac v.1.8 (ref. 54). La función 'DefaultAssay' se utilizó para el ensayo de ARN. Para la visualización de datos de ARN, la característica se estableció en 3000 con la función 'FindVariableFeatures', luego los datos se normalizaron con la función 'SCTransform'. Los datos de ARN normalizados se agruparon y se construyó UMAP de ARN. La función DefaultAssay se aplicó al ensayo ATAC/CUT&Tag. Para la visualización de datos ATAC/CUT&Tag, el corte mínimo se estableció con la función 'FindTopFeatures'. Los datos se normalizaron y se redujeron dimensionalmente mediante la indexación semántica latente, luego se agruparon los datos de ATAC/CUT&Tag y se construyó ATAC/CUT&Tag UMAP.

La función DefaultAssay se utilizó para el ensayo conjunto ATAC/CUT&Tag y RNA. Para la visualización de datos conjuntos de ATAC/CUT&Tag y RNA55, se utilizó la función 'FindMultiModalNeighbors'. La lista de reducción se fijó en ('pca', 'lsi'), la lista de dimensiones se fijó en la de RNA y ATAC/CUT&Tag, la modalidad peso.nombre se fijó en peso de RNA y se construyó la UMAP conjunta.

Para trazar juntos los UMAP generados anteriormente, DefaultAssay se configuró en RNA y los UMAP para ATAC/CUT&Tag, RNA o ATAC/CUT&Tag y RNA conjuntos se visualizaron por separado usando 'DimPlot'.

Con respecto a la visualización de datos espaciales de ARN, la matriz de genes obtenida de ARN se cargó en Seurat v.4.1 (ref. 56) como un objeto Seurat, y los metadatos de ARN obtenidos de Signac se leyeron en el objeto Seurat. Luego, todos los mapas espaciales se trazaron con la función 'SpatialPlot'.

Con respecto a la visualización de datos espaciales de ATAC/CUT&Tag, el archivo de fragmentos obtenido de ATAC/CUT&Tag se leyó en ArchR v.1.0.1 (ref. 13) como un ArchRProject y los metadatos de ATAC/CUT&Tag obtenidos de Signac se leyeron en ArchRProject. Los datos de ArchRProject se normalizaron y se redujeron dimensionalmente mediante indexación semántica latente iterativa. Para el cálculo de GAS y CSS utilizamos el modelo Gene Score en ArchR. Se obtuvo una matriz de puntuación de genes para el análisis posterior. Las funciones 'getMarkerFeatures' y 'getMarkers' en ArchR (testMethod = "Wilcoxon", cutOff = "FDR <= 0.05", groupBy = "seurat_cluster") se usaron para encontrar los genes/regiones marcadores para cada grupo. Para visualizar los datos espaciales, los resultados obtenidos de ArchR se ingresaron en Seurat v.4.1 para mapear los datos en el tejido. El tamaño de píxel se escaló utilizando el parámetro 'pt.size.factor' en el paquete Seurat para una mejor visualización.

Para los enlaces de pico a gen, ingresamos el objeto RNA Seurat usando la función 'addGeneIntegrationMatrix' en ArchR, luego los enlaces de pico a gen se dibujaron con la función 'addPeak2GeneLinks'. La coaccesibilidad de los picos se calculó utilizando la función 'addCoAccessibility' en ArchR.

Seurat v.4.1 (ref. 56) se utilizó para la integración de datos de ARN y la identificación del tipo de célula, y la función 'SCTransform' para normalizar nuestros datos espaciales de ARN y scRNA-seq. Se utilizó la función 'SelectIntegrationFeatures' para obtener características comunes a los dos conjuntos de datos. Se aplicó la función 'FindIntegrationAnchors' para encontrar anclas y la función 'IntegrateData' para crear un conjunto de datos integrado a través de las anclas identificadas. El conjunto de datos integrado obtenido se agrupó, mostrando una buena coincidencia entre nuestros datos de RNA espacial y scRNA-seq. La función 'FindTransferAnchors' se usó para encontrar anclas de transferencia, que luego se usaron para realizar la transferencia de etiquetas con la función 'TransferData' (si se presentaba más de un tipo de celda en un píxel, se asignaba el tipo de celda principal).

Signac v.1.8 y Seurat v.4.1 se utilizaron para la integración de nuestros datos ATAC/CUT&Tag y scATAC-seq/scCUT&Tag. Los datos de scATAC-seq/scCUT&Tag se cuantificaron de acuerdo con nuestros datos de ATAC/CUT&Tag para garantizar que hubiera características comunes en ambos conjuntos de datos. La función FindIntegrationAnchors (reducción = "rlsi") se utilizó para identificar los anclajes entre los dos conjuntos de datos. Se utilizó la función 'IntegrateEmbeddings' para obtener un conjunto de datos integrado a través de los anclajes identificados. El conjunto de datos integrado obtenido se agrupó, mostrando una buena coincidencia entre nuestros datos espaciales ATAC/CUT&Tag y scATAC-seq/scCUT&Tag. Para los datos ATAC, se usó la función FindTransferAnchors para encontrar anclas de transferencia, que luego se usaron para asignar scATAC-seq a nuestros datos ATAC espaciales con la función 'MapQuery'.

ArchR v.1.0.1 se utilizó para la identificación del tipo de célula para nuestros datos ATAC/CUT&Tag a partir de datos scRNA-seq. La matriz de puntuación génica de nuestro ATAC/CUT&Tag se comparó con la matriz de expresión génica de scRNA-seq y los píxeles alineados de nuestros datos de ATAC/CUT&Tag con células de scRNA-seq. La función 'GeneIntegrationMatrix' se usó para agregar perfiles de pseudo-scRNA-seq e identidades celulares.

Se realizó un análisis de correlación para diferentes regiones de tejido. El hemisferio del cerebro del ratón se separó en siete grupos (cuerpo calloso, cuerpo estriado, capa cortical superficial, capa cortical más profunda, ventrículo lateral, núcleo septal lateral y otros) de acuerdo con los grupos de ARN y la anotación anatómica, y se denominó 'grupos de tejido'. Para la Fig. 4a–c, se utilizó la función 'FindMarkers' (configuración: min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25) para calcular nuestros datos de ARN y los genes con P ajustada < 10−5 seleccionados como genes marcadores. Se aplicó la función getMarkerFeatures (configuración: groupBy = "tissue_clusters") para calcular el GAS o CSS de los genes de la lista de genes marcadores (cutOff = "FDR <= 0.05" & (cutOff = "Log2FC >= 0.1" o cutOff = " Log2FC <= −0.1")). Si avg_log2FC > 0 (RNA) y Log2FC > 0 (CUT&Tag) para un gen específico, se mostró en el cuadrante I. El análisis de enriquecimiento GO se realizó con la función 'enrichGO' (qvalueCutoff = 0.05) en el paquete clusterProfiler v.4.225.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar y procesados ​​informados en este documento se depositan en Gene Expression Omnibus con el código de acceso GSE205055. Estos conjuntos de datos están disponibles como recursos web y se pueden explorar dentro de las coordenadas espaciales del tejido en el Navegador de células y genomas de UCSC (https://brain-spatial-omics.cells.ucsc.edu), y en nuestro propio portal de datos generado con AtlasXplore (https://web.atlasxomics.com/visualization/Fan). Los datos también están disponibles en https://ki.se/en/mbb/oligointernode. Los archivos fastq resultantes se alinearon con el genoma de referencia humano (GRCh38) (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/chromosomes/) o con el genoma de referencia del ratón (GRCm38) (https://hgdownload.soe ucsc.edu/goldenPath/mm10/cromosomas/). Los datos publicados para la integración y la comparación de calidad están disponibles en línea: ENCODE ATAC-seq (embrión de ratón E13.5) (https://www.encodeproject.org/search/?type=Experiment&status=released&related_series.@type=OrganismDevelopmentSeries&replicates.library.biosample .organism.scientific_name=Mus+musculus&assay_title=ATAC-seq&life_stage_age=embryonic%2013.5%20days); ENCODE RNA-seq (embrión de ratón E13.5): cerebro anterior (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78493); cerebro medio (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78456); cerebro posterior (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78481); atlas de células de organogénesis de ratón (https://oncoscape.v3.sttrcancer.org/atlas.gs.washington.edu.mouse.rna/downloads); atlas de elementos reguladores de genes en cerebro de ratón adulto (http://catlas.org/mousebrain/#!/downloads); atlas del cerebro del ratón adolescente (http://mousebrain.org/adolescent/downloads.html); datos de scCUT&Tag H3K27ac de cerebro de ratón (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949207); datos de scCUT&Tag H3K27me3 de cerebro de ratón (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949205); datos de scCUT&Tag H3K4me3 de cerebro de ratón (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE163532); hipocampo humano (snRNA-seq) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE186538; e hipocampo humano (scATAC-seq) (https://www.ncbi .nlm.nih.gov/geo/query/a cc.cgi?acc=GSE147672). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código para el análisis de datos de secuenciación está disponible en Github (https://github.com/di-0579/Spatial_epigenome-transcriptome_co-sequencing) y archivado en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7395313).

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Agradecemos al Yale Center for Research Computing por la orientación y el uso de la infraestructura informática de investigación. Los moldes para dispositivos de microfluidos se fabricaron en el Centro de Nanofabricación de la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas de la Universidad de Yale. NGS se llevó a cabo en el Yale Center for Genome Analysis y en Yale Stem Cell Center Genomics Core Facility, con el apoyo del Fondo de Investigación de Medicina Regenerativa de Connecticut y la Fundación Li Ka Shing. Se utilizó el servicio proporcionado por Genomics Core of Yale Cooperative Center of Excellence in Hematology (n.º U54DK106857). Agradecemos a T. Jimenez-Beristain por escribir permisos de ética de animales de laboratorio y asistencia con experimentos con animales, y al personal de Medicina Comparada-Biomedicum. M. Bartosovic fue financiado por la subvención del Sello de excelencia de Vinnova Marie-Sklodowska Curie Actions. Visión centrada en el ARN sobre el desarrollo del linaje de oligodendrocitos (RODent). EA fue financiado por la Unión Europea, Horizon 2020, Marie-Sklodowska Curie Actions y la subvención SOLO (no. 794689). El trabajo en el grupo de investigación de GC-B. fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación (subvención n.º 2019-01360), la Sociedad Sueca del Cáncer (Cancerfonden, n.º 190394 Pj), la Fundación Knut y Alice Wallenberg (subvención n.º 2019 -0107 y 2019-0089), la Sociedad Sueca de Investigación Médica (subvención no. JUB2019), la Fundación Göran Gustafsson para la Investigación en Ciencias Naturales y Medicina, el Centro Ming Wai Lau de Medicina Reparadora y el Instituto Karolinska. Esta investigación fue apoyada por Packard Fellowship for Science and Engineering (para RF), Yale Stem Cell Center Chen Innovation Award (para RF) y los Institutos Nacionales de Salud de EE. a RF). YL fue apoyado por la Society for ImmunoTherapy of Cancer Fellowship.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Karolinska.

Yan Xiang Deng

Dirección actual: Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Instituto de Epigenética, Facultad de Medicina Perelman, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Di Zhang, Yanxiang Deng

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Di Zhang, Yanxiang Deng, Graham Su, Shuozhen Bao, Yang Liu y Rong Fan

Yale Stem Cell Center y Yale Cancer Center, Facultad de Medicina de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Yanxiang Deng, Graham Su, Yang Liu y Rong Fan

Laboratorio de Neurobiología Molecular, Departamento de Bioquímica Médica y Biofísica, Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia

Petra Kukanja, Eneritz Agirre, Marek Bartosovic y Gonçalo Castelo-Branco

Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Mingze Dong, Yuval Kluger y Rong Fan

Programa Interdepartamental de Biología Computacional y Bioinformática, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Mingze Dong y Yuval Kluger

Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad de Princeton, Princeton, NJ, EE. UU.

Cong Ma y Benjamin J. Raphael

Observatorio de células Klarman, Instituto Broad del MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

sai ma

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Yang Xiao y Kam W. Leong

Departamento de Psiquiatría, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Gorazd B. Rosoklija, Andrew J. Dwork, J. John Mann y Maura Boldrini

División de Imágenes Moleculares y Neuropatología, Instituto Psiquiátrico del Estado de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Gorazd B. Rosoklija, Andrew J. Dwork, J. John Mann y Maura Boldrini

Academia de Ciencias y Artes de Macedonia, Skopje, República de Macedonia

Gorazd B. Rosoklija y Andrew J. Dwork

Departamento de Patología y Biología Celular, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Andrew J. Dwork

Departamento de Radiología, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

J. Juan Mann

Departamento de Biología de Sistemas, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Kam W Leong

AtlasXomics, Inc., New Haven, CT, EE. UU.

liya wang

Instituto de Genómica, Universidad de California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE. UU.

Maximiliano Haeussler

Programa de Matemáticas Aplicadas, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

yuval kluger

Centro Ming Wai Lau de Medicina Reparadora, Nodo de Estocolmo, Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia

Gonçalo Castelo-Branco

Programa de Inmunología Humana y Traslacional, Facultad de Medicina de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Abanico Rong

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RF conceptualizó el estudio. DZ, YD e YL fueron los responsables de la metodología. DZ y YD llevó a cabo la investigación experimental. DZ, YD, PK, EA, M. Bartosovic, MD, CM, SM, BJR, YK, GC-B. y RF fueron responsables del análisis de datos. PK, GS, SB, YX, KWL, GBR, AJD, JJM y M. Boldrini fueron los encargados de conseguir los recursos. LW y MH fueron los responsables del buscador de datos. DZ, YD y RF escribieron el borrador original. Todos los autores revisaron, editaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Yanxiang Deng, Gonçalo Castelo-Branco o Rong Fan.

RF, DZ y YD son inventores de una divulgación provisional de patente relacionada con este trabajo. RF es fundador científico y asesor de IsoPlexis, Singleron Biotechnologies y AtlasXomics. Los intereses de RF fueron revisados ​​y gestionados por la Oficina del Rector de la Universidad de Yale de acuerdo con las políticas de conflicto de intereses de la universidad. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature agradece a Steven Henikoff, Erica Scott y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Flujo de trabajo esquemático de espacial-ATAC-RNA-seq y espacial-CUT&Tag-RNA-seq. b – c, Flujo de trabajo de química de ATAC (b) y ARN (c) en espacial-ATAC-RNA-seq. d–e, Flujo de trabajo de química de CUT&Tag (d) y RNA (e) en CUT&Tag-RNA-seq espacial.

a, imagen H&E de una sección de tejido adyacente de embrión de ratón E13. b, Mapeo espacial de GAS y expresión génica para genes marcadores seleccionados en espacial-ATAC-RNA-seq. c, Integración de datos de scRNA-seq12 de embriones de ratón E13.5 con datos de ATAC y RNA en ATAC-RNA-seq espacial. MOCA, Atlas de células de organogénesis de ratón. d, Mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scRNA-seq12 a ATAC (arriba) y RNA (abajo). e, Visualización del seguimiento del genoma de genes marcadores con enlaces pico a gen para elementos reguladores distales y coaccesibilidad máxima. f, el nivel de expresión y el porcentaje de píxeles en todos los grupos (genes marcadores para cada grupo) para datos de ARN en espacial-ATAC-ARN-seq. g, Diagrama de puntos que muestra la identificación de reguladores TF positivos. h, Mapeo espacial de puntuaciones de desviación para motivos TF seleccionados. i, Anotación de picos de marcadores en diferentes grupos. j, GRAN análisis de enriquecimiento de picos de marcadores en diferentes grupos (Pruebas binomiales e hipergeométricas).

a, análisis de enriquecimiento GO para genes de la Fig. 1g. b,c, análisis de pseudotiempo de glía radial a neuronas prematuras posmitóticas con GAS (b) y expresión génica (c). d, análisis de Monocle2 que muestran diferentes estados en (b). e, Mapa de calor de diferentes estados a lo largo de la trayectoria del pseudotiempo. f, análisis GO de genes en el cuadro rojo de (e) (versión unilateral de la prueba exacta de Fisher, el valor p se ajustó para comparaciones múltiples mediante el método de Benjamini y Hochberg).

a, mapeo espacial de puntuaciones de actividad génica y expresión génica para genes marcadores seleccionados en espacial-ATAC-RNA-seq. b, Visualización del seguimiento del genoma de genes marcadores con enlaces pico a gen para elementos reguladores distales y coaccesibilidad máxima. c, Mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scATAC-seq30 a datos ATAC. TI: intratelencefálica. PT: tracto piramidal. NP: casi proyectado. TC: corticotalámico. L: capa. d, Mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scRNA-seq32 a datos de ARN.

a, Candidatos a reguladores de TF de Sox2, Pax6 y Mobp. Los puntos resaltados son TF con abs (puntuación de regulación) ≥ 1 (escala −log10)33, con todos los demás TF mostrados en gris (prueba Z). b, Mapeo espacial de puntuaciones de desviación para motivos TF seleccionados. c, mapas de calor de enlaces de pico a gen en espacial-ATAC-RNA-seq. d, el número de picos significativamente correlacionados para cada gen.

a—c, Distribución espacial y UMAP de todos los grupos para ATAC (a), ARN (b) y agrupación conjunta de ATAC y ARN (c) en ATAC-ARN-seq espacial para el cerebro del ratón. Tamaño de píxel, 20 µm. Barra de escala, 1 mm. d, imagen teñida con Nissl de una sección de tejido adyacente del cerebro del ratón P21. Barra de escala, 1 mm. e, Integración de datos ATAC en espacial-ATAC-RNA-seq con datos scATAC-seq30 de cerebro de ratón. f, Integración de datos de ARN en ATAC-RNA-seq espacial con datos de scRNA-seq32 de cerebro de ratón. g, mapeo espacial de GAS y expresión génica para genes marcadores seleccionados en diferentes grupos para ATAC y ARN en espacial-ATAC-RNA-seq.

a, Integración de datos de CUT&Tag (H3K4me3) en CUT&Tag-RNA-seq espacial con datos36 de scCUT&Tag (H3K4me3) de cerebro de ratón. b, Integración de datos de ARN en CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq espacial, CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq y CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq espacial con datos scRNA-seq32 de cerebro de ratón. ce, integración de datos de ARN en CUT&Tag espacial (H3K27me3)-RNA-seq (c), datos de ARN en datos en CUT&Tag espacial (H3K27ac)-RNA-seq (d) y datos de ARN en CUT&Tag espacial (H3K4me3) -RNA-seq (e) con scRNA-seq data32 de cerebro de ratón. f, Mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scRNA-seq32 a datos de RNA en CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq espacial. g, Mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scRNA-seq32 a RNA (arriba) y de scRNA-seq32 a datos de CUT&Tag (H3K27ac, abajo) en datos de CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq espacial. h, mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scRNA-seq32 a RNA (arriba) y de scRNA-seq32 a datos de CUT&Tag (H3K4me3, abajo) en datos de CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq espacial.

ac, distribución espacial y UMAP de todos los grupos para CUT&Tag (H3K27ac) (a), RNA (b) y agrupamiento conjunto de CUT&Tag (H3K27ac) y RNA (c) en CUT&Tag-RNA-seq espacial para el cerebro del ratón. Tamaño de píxel, 20 µm. Barra de escala, 1 mm. d, imagen teñida con Nissl de una sección de tejido adyacente del cerebro del ratón P21. Barra de escala, 1 mm. e, Integración de datos CUT&Tag (H3K27ac) en CUT&Tag-RNA-seq espacial con datos scCUT&Tag (H3K27ac)37 de cerebro de ratón. f, Integración de datos de ARN en corte espacial y etiqueta-ARN-seq con datos de scRNA-seq32 de cerebro de ratón.

ag, mapeo espacial de CSS, GAS y expresión génica de Mal (a), Mag (b), Car2 (c), Grin2b (d), Syt1 (e), Gpr88 (f) y Ptprz1 (g) de ATAC y ARN en espacial-ATAC-RNA-seq y CUT&Tag (H3K27me3, H3K27ac o H3K4me3) y ARN en espacial-CUT&Tag-RNA-seq. h, Mapeo espacial de CSS y expresión génica de Nav3, Sncb, Ablim2 y Gng7 en CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq espacial.

a, Mapeo espacial de tipos de células identificados por transferencia de etiquetas de scRNA-seq43 a datos de ARN en ATAC-ARN-seq espacial para hipocampo humano. b, Diagrama de puntos que muestra la identificación de reguladores TF positivos. c, mapeo espacial de puntuaciones de desviación para motivos TF seleccionados en espacial-ATAC-RNA-seq.

Figs suplementarias. 1–14, tablas 2–7 y estadísticas y reproducibilidad.

Una lista de anotaciones de tipos de células en el cerebro del ratón.

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Zhang, D., Deng, Y., Kukanja, P. et al. Epigenoma espacial-transcriptoma co-perfilado de tejidos de mamíferos. Naturaleza 616, 113–122 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

Descargar cita

Recibido: 06 junio 2022

Aceptado: 03 febrero 2023

Publicado: 15 de marzo de 2023

Fecha de emisión: 06 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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